تنقية الببتيدات

للحصول على ببتيدات ذات تسلسلات حمض أميني محددة، نستخدم طريقة Fmoc-SPPS (합성 الببتيد الصلب).

الخلفية:

الببتيدات هي مواد بيولوجية نشطة مرتبطة بوظائف خلوية مختلفة في الكائنات الحية. يتكون بنيانها الجزيئي بين الأحماض الأمينية والبروتينات، ويتألف من عدة أحماض أمينية مرتبة بنظام معين ومرتبطة بروابط ببتيدية (—NH—CO—). تُسمى المركبات الناتجة عن التكثيف بالتخلص من الماء بين جزيئين من الأحماض الأمينية بالببتيد ثنائي، وبالمثل هناك ثلاثي الببتيد، رباعي الببتيد، خماسي الببتيد، وهكذا حتى غيري الببتيد. عادةً ما تُسمى المركبات المكونة من 10 إلى 100 جزيء من الأحماض الأمينية والتي تتكون بالتخلص من الماء الببتيدات متعددة.

تشير خدمات الببتيدات المخصصة إلى تكوين الببتيدات بناءً على متطلبات العميل، مثل التسلسل، والنقاء، والوزن الجزيئي، ومحتوى الملح، لتلبية الاحتياجات المحددة. يتم تأكيد الوزن الجزيئي باستخدام الطيف الكتلي للتأكد من صحة MS الخام، ثم تنقية باستخدام نظام كروماتوجرافي سائل عالي الأداء، ثم التركيز والتجميد للاستفادة للحصول على مسحوق ببتيد نقي.

للحصول على ببتيدات ذات تسلسلات حمض أميني معينة، نستخدم طريقة Fmoc-SPPS (تكوين الببتيدات بالمرحلة الصلبة). أثناء التكوين بالمرحلة الصلبة، يتم إدخال مجموعة قادرة على التفاعل مع المجموعات الكربوكسيلية على الحامل الصلب للتفاعل مع الحمض الأميني المحمي بالأمين، مما يربط الحمض الأميني الأول بالراتنج. ثم يتم إكمال التفاعل من النهاية C إلى النهاية N لإتمام تكوين السلسلة الببتيدية المستهدفة.

طرق التنقية:

تستخدم شركتنا نظام كروماتوغرافيا سائلة عالي الأداء مع عمود فصل مسبق من نوع C18 العكسي للفصل والتنقية، وفقًا للخطوات التالية:

التعرف: خذ كمية صغيرة من الببتيد الخام لتحليل الطيف الكتلي لتأكيد وجود الببتيد المستهدف (إذا كان نعم، أكد وقت الاحتفاظ في عمود C18 من خلال الكروماتوغرافيا التحليلية؛ إذا كان لا، أعد تكوين الببتيد الخام).

الذوبان: استخدم المساعدة بالموجات فوق الصوتية للذوبان، عادةً يتم اختيار 90% ماء + 10% أسيتونتريل (أو الميثانول أو الإيزوبروبانول). بالنسبة للذوبانية الصعبة، أضف حمض خلاتي أو حمض ثلاثي فلوري أسيتيك مناسبًا لتسهيل الذوبان إذا كانت السلسلة تحتوي على نسبة عالية من الأحماض الأمينية الأساسية؛ أضف ماء أمونيا مناسبًا إذا كانت الأحماض الأمينية الحمضية هي السائدة. استخدم DMSO (كبريتات ثنائي الميثيل) إذا كانت الأحماض الأمينية الهيدروفوبية هي السائدة.

الترشيح: صفي المنتج الخام المذاب عبر غشاء مرشح بحجم 0.45 ميكرومتر (لحماية العمود التحضيري) للاستخدام لاحقًا.

تحميل العينة: استخدم النظام السائل ذي الأداء العالي لإدخال العينة السائلة في العمود التحضيري.

التنقية: بناءً على التدرج التنقيحي الذي تم تحديده في الخطوة 1)، فصل الشوائب عن الببتيدات باستخدام الفروقات في القطب بين الببتيدات ذات الأطوال المختلفة.

مزايا استخدام نظام الكروماتوغرافيا السائلة ذي الأداء العالي:

دقة أعلى من طرق الكروماتوغرافيا الأخرى؛ يمتلك العمود التحضيري C18 كفاءة عمود عالية، وعمر خدمة طويل، وإعادة إنتاج جيدة، مما يسمح بالاستخدام المتكرر؛ سرعة وفعالية عالية، حيث يتم تنقية كل عينة خلال دقائق أو عشرات الدقائق؛ تطبيق واسع وتقنية ناضجة للكروماتوغرافيا الطور العكسي، مما يقدم اختيارية جيدة لأنواع مختلفة من المركبات العضوية.

تنقية الببتيد الخام وتجميده:

يتم فصل الببتيد الخام وتنقيته باستخدام نظام كروماتوغرافي سائل عالي الأداء للتحضير وتُحلل لتحديد درجة نقاءها باستخدام جهاز الكروماتوغراف السائل عالي الأداء (HPLC) للحصول على المكونات السائلة المؤهلة.

نظام التبخير الدوراني: يتم تعريض المكون السائل المؤهل لتسخين تحت ضغط منخفض لإزالة المواد العضوية المتطايرة بسهولة، مما يؤدي في النهاية إلى الحصول على محلول يحتوي على الببتيد المستهدف، والذي يُوضع بعد ذلك في ثلاجة لتجميده على شكل بلورات ثلج صلبة.

نظام التجفيف بالتجميد: توضع الحاويات التي تحتوي على البلورات الثلجية الصلبة على رفوف جهاز التجفيف بالتجميد أو فتحة الشفط. وفي بيئة شبه خالية من الهواء، يتم تبخير منتج الببتيد ليتم الحصول في النهاية على مسحوق ببتيد صلب.

جاهزية بلورات الببتيد للتجفيف بالتجميد داخل جهاز التجفيف.