Чыстка пептыдаў

Для атрымання пептыдаў з спецыфічнымі амінанавымі секвенцыямі мы выкарыстоўваем метад Fmoc-SPPS (сцвяродфазавае сінтэз пептыдаў).

Кантэксц:

Пептыды — гэта біядаўнасныя ўзро́ды, якія адносяцца да розных клетачных функцый у біялагічных арганізамах. Іх молекулярная структура знаходзіцца паміж амінавымі кіслінамі і белкамі, складаючыся з некалькіх амінавых кіслін, выкладзеных у спецыфічным парадку і злучаных пептыднымі сувязямі (—NH—CO—). Злучэнні, утвараныя дэгідратацыйнай канденсацыяй двух амінавых кіслін, называюцца дыпептыдамі, таксама існуюць трэціпептыды, тэтрапептыды, пентапептыды і так далей да нонапептыдаў. Звычайна злучэнні, утвараныя з 10 да 100 амінавых кіслін праз дэгідратацыйную канденсацыю, называюцца поліпептыдамі.

Пептыдныя цэлодзейныя сэрвісы адносяцца да сінтэза пептыдаў з улікам патрабаванняў кліента, такіх як парадак, чыстасць, молекулярная вага і салавая ўмова, каб задавальняць спецыфічныя патрабаванні. Молекулярная вага падтвараецца мас-спектраметрыяй, каб пераконаться у правільнасці грубай MS, пасля чаго выконваецца чыстанне з выкарыстаннем сістэмы високаправядливаснага жыдкага хроматаграфавання, затым канцэнтрацыя і ліофілізацыя для атрымання дробленага пептыднага паўдзю.

Каб атрымаць пептыды з спецыфічнымі амінокіслотнымі парадкамі, мы выкарыстоўваем метад Fmoc-SPPS (сінтэз пептыдаў на твердай фазе). Падчас сінтэза на твердай фазе на твердым нاقравадніку ўводзіцца група, здольная рэагаваць з карбаксыльнымі групамі, каб рэагаваць з аміна-захаванай амінокіслотай, прычым першая амінокіслота закріпляецца на рэзіну. Рэакцыя завершаецца ад C-канца да N-канца для завяршэння сінтэза цэлевага пептыднага парадку.

Методы чыстання:

Наша кампанія выкарыстоўвае сістэму високап拉цавай жыдкай хроматаграфіі з адваротнай падготавляючай коланой C18 для разлучэння і чысценні, наступнымі крокамі:

Ідэнтыфікацыя: Узьміце малую колькасць нечысты пептыда для мас-спектраметрыйнай ідэнтыфікацыі, каб пацвердзіць наяўнасць цэлевога пептыда (калі так, пацвердзіце яго час задзяржання ў аналітычнай колане C18; калі няма, перасынтэзуйце нечысты пептыд).

Дысольванне: Выкарыстоўвайце ультразвукоўую дапамогу для дысольвання, абвёсці 90% воды + 10% ацэтаналю (метанал або ізопрапанал). У выпадку затрудненага дысольвання дадайце дастатачна ацэтычнай цыдры або трэфлюарызаванай цыдры, каб дапамагчы дысольванню, калі сеціў мае больш базавых амінокіслот; дадайце дастатачна амійнай вады, калі домініруюць кіслыя амінокіслоты. Выкарыстоўвайце DMSO (дыметыл сульфоксыд), калі домініруюць гідрофобныя амінокіслоты.

Фільтрацыя: Пrafільтруйце розчин нечыстага праductу праз фільтр 0.45 µm (каб захаваць падготавляючую колану) для далейшага выкарыстання.

Загрузка пробы: Выкарыстоўвайце высоцкаапасную сістэму падготунку раствара для ўводу раствару ў колонку падготовкі.

Элюцыя: На аснове элюцыйнага градыента, які быў вызначаны ў кроку 1), аддзеліце забараўныя рэчывіны ад пептыдаў з дапамогай разнастай палярнасці пептыдаў розных даўжын.

Перавагі выкарыстання высоцкаапаснай сістэмы хроматаграфіі:

Вышэйшая разлучальная спасабнасць, чым у іншых метадах хроматаграфіі; выкарыстоўваная колонка C18 мае високую калонную эфектыўнасць, даўгі срок службі і добрае воспараваемасць, што дазваляе яе многакратнае выкарыстанне; швидкая шынт і высоцкая эфектыўнасць, кожны пробырэкт чыстыся за хвіліны ці дзесяткі хвілін; шырокае прымяненне і дасконала тэхналогія абваротнай фазы хроматаграфіі, якая прынімае добрыя выбары для розных тыпаў органічных злучэнняў.

Чысценне нечыстых пептыдаў і ліофілізацыя:

Няпростая пептыдная суміш аддзяляецца і чыстіцца з дапамогай сістэмы выспробы ў высоцкадапуснаснай цыркуляцыі раствараў, а потым чыстыцца з дапамогай высоцкадапуснаснага хроматографа (HPLC), каб атрымаць кваліфікаваныя растварныя кампаненты.

Сістэма вяртаннага выпарвання: кваліфікаваны растварны кампанент паддаецца вакуумнаму выпарванню для вылічэння лёгка выпаральных органічных салодаваў, у выніку чаго атрымліваецца раствар, які ўключае мэтавы пептыд, які потым размяшаецца ў мраззілке, каб утварыць твердую кристалічную форму.

Сістэма мраззіллення: ёмкі, якія трzymаюць твердую кристалічную форму, ставяцца на поду мраззілальнага апарату ці вакуумнага працэсу. У вакуумным середдові, пептыдны продукт выпарваецца, што ў выніку дае твердую пудру з пептыдаў.

Кристалы пептыда гатовы для мраззіллення ў мраззілальніку.