Peptidreinigung

Um Peptide mit spezifischen Aminosäuresequenzen zu erhalten, verwenden wir die Fmoc-SPPS-Methode (Festphasen-Peptidsynthese).

Hintergrund:

Peptide sind bioaktive Substanzen, die mit verschiedenen zellulären Funktionen in biologischen Organismen zusammenhängen. Ihre Molekülstruktur liegt zwischen Aminosäuren und Proteinen, besteht aus mehreren Aminosäuren, die in einer bestimmten Reihenfolge angeordnet sind und durch Peptidbindungen (—NH—CO—) miteinander verbunden sind. Durch die Dehydrationskondensation von zwei Aminosäuremolekülen entstehende Verbindungen werden Dipeptide genannt, entsprechend gibt es Tripeptide, Tetrapeptide, Pentapeptide und so weiter bis zu Nonapeptiden. Verbindungen, die typischerweise aus 10 bis 100 Aminosäuremolekülen durch Dehydrationskondensation bestehen, werden Polypeptide genannt.

Peptid-Serviceleistungen beziehen sich auf die Synthese von Peptiden auf Basis der Kundenanforderungen, wie Sequenz, Reinheit, Molekulargewicht und Salzgehalt, um spezifische Bedürfnisse zu erfüllen. Das Molekulargewicht wird durch Massenspektrometrie bestätigt, um die Richtigkeit des Roh-MS sicherzustellen, gefolgt von einer Reinigung mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem, dann Konzentration und Lyophilisierung, um das feine Peptidpulver zu erhalten.

Um Peptide mit spezifischen Aminosäuresequenzen zu erhalten, verwenden wir die Fmoc-SPPS-Methode (festphasenbasierte Peptidsynthese). Während der Festphasensynthese wird eine Gruppe, die in der Lage ist, mit Carbonsäuregruppen zu reagieren, auf dem Festphasenträger eingeführt, um mit dem aminogeschützten Amin zu reagieren und die erste Aminosäure an die Harze anzubinden. Die Reaktion wird dann vom C-Ende zum N-Ende abgeschlossen, um die Synthese der Zielpeptidsequenz zu vollenden.

Reinigungsverfahren:

Unsere Firma verwendet ein Hochleistungsflüssigkeitschromatographiensystem mit einer umgekehrten C18-Vorbereitungssäule für Trennung und Reinhaltung, wobei folgende Schritte beachtet werden:

Kennzeichnung: Nehmen Sie eine kleine Menge rohes Peptid zur Massenspektrometrie, um das Vorhandensein des Zielpeptids zu bestätigen (falls ja, bestätigen Sie seine Retentionzeit in der C18-Säule durch analytische Chromatographie; falls nein, resynthesieren Sie das rohe Peptid).

Auflösung: Verwenden Sie Ultraschallunterstützung zur Auflösung, typischerweise wird 90 % Wasser + 10 % Acetonitril (Methanol oder Isopropanol) ausgewählt. Bei schwerer Löslichkeit können Sie bei einer höheren Proportion basischer Aminosäuren angemessene Essigsäure oder TrifluorEssigsäure hinzufügen, um die Auflösung zu erleichtern; fügen Sie angemessenes Ammoniakwasser hinzu, wenn saure Aminosäuren vorherrschen. Verwenden Sie DMSO (Dimethylsulfoxid), wenn hydrophobe Aminosäuren vorherrschen.

Filterung: Filtern Sie das aufgelöste Rohprodukt durch eine 0,45 µm Filtermembran (um die Vorbereitungssäule zu schützen) für spätere Verwendung.

Probenbeladung: Verwenden Sie das Hochleistungs-Flüssigkeitsvorbereitungssystem, um die Flüssigkeitsprobe in die Vorbereitungssäule einzuführen.

Elution: Basierend auf dem in Schritt 1) bestimmten Elutionsgradienten, trennen Sie Unreinheiten von Peptiden unter Verwendung der Polaritätsunterschiede von Peptiden unterschiedlicher Länge.

Vorteile der Verwendung eines Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesystems:

Höhere Auflösung als andere Chromatographiemethoden; die verwendete C18-Vorbereitungssäule hat eine hohe Säulenwirksamkeit, eine lange Lebensdauer und eine gute Reproduzierbarkeit, was wiederholte Verwendungen ermöglicht; hohe Geschwindigkeit und Effizienz, wobei jedes Probe innerhalb von Minuten oder einigen zehn Minuten gereinigt wird; weite Anwendung und reife Technologie der Reversphasenchromatographie, die eine gute Selektivität für verschiedene Arten organischer Verbindungen bietet.

Rohpeptid-Reinigung und Lyophilisierung:

Das rohe Peptid wird mittels eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Vorbereitungssystems getrennt und gereinigt und auf Reinheit mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC) analysiert, um die qualifizierten flüssigen Komponenten zu erhalten.

Drehverdampfungssystem: Die qualifizierte flüssige Komponente wird bei Vakuum erhitzt, um leicht verflüchtige organische Lösungsmittel zu entfernen. Schließlich wird eine Lösung mit dem Zielpeptid erhalten, die dann in einen Gefrierschrank gelegt wird, um feste Eiskristalle zu bilden.

Tiefgefrier-Trocknungssystem: Behälter mit den festen Eiskristallen werden auf dem Tablett oder am Vakuumanchluss des Tiefgefrier-Trocknungsgeräts platziert. In einer Vakuumumgebung wird das Peptidprodukt sublimiert, wodurch letztendlich ein festes Peptidpulver entsteht.

Die Peptidkristalle sind bereit, im Tiefgefreezer trockengefroren zu werden.