Καθαρισμός Πεπτιδίων

Για να λάβουμε πεπτίδια με συγκεκριμένες αλληλουσιώδεις ακολουθίες, χρησιμοποιούμε τη μέθοδο Fmoc-SPPS (σύνθεση πεπτιδίων σε κατάσταση άλλου).

Πίσωθεν:

Τα πεπτίδια είναι βιοακτιβά υλικά που σχετίζονται με διάφορες κυτταρικές λειτουργίες σε βιολογικά οργανισμούς. Η μοριακή τους δομή βρίσκεται ανάμεσα στα αμινοξέα και τα πρωτεΐνες, αποτελούμενη από πολλά αμινοξέα που διατίθενται σε συγκεκριμένη σειρά και συνδέονται με πεπτιδικά δεσμά (—NH—CO—). Τα συνθέτα που σχηματίζονται από την αποψιδωτική συμπάγωση δύο μοριών αμινοξέων ονομάζονται διπεπτίδια, παρόμοια υπάρχουν τριπεπτίδια, τετραπεπτίδια, πενταπεπτίδια και έτσι μέχρι τα εννεαπεπτίδια. Τα σύνθετα που συνήθως σχηματίζονται από 10 έως 100 μόρια αμινοξέων μέσω αποψιδωτικής συμπάγωσης ονομάζονται πολυπεπτίδια.

Τα προσαρμοστικά υπηρεσίες πεπτιδίων αφορούν τη σύνθεση πεπτιδίων βάσει των απαιτήσεων του πελάτη, όπως ακολουθία, καθαρότητα, μοριακό βάρος και περιεχόμενο άλατος, για να καλύψουν συγκεκριμένες ανάγκες. Το μοριακό βάρος επιβεβαιώνεται με τη χρήση μαζικού φασματοσκοπίου για να εξασφαλιστεί η σωστότητα του ακαθάριστου MS, ενώ ακολουθεί καθαρισμός με χρήση συστήματος υψηλής απόδοσης υγρού χρωματογράφημα, στη συνέχεια συγκέντρωση και λυοφιλοποίηση για να προκύψει το λεπτό πορίσμα πεπτιδίου.

Για να προσκομιστούν πεπτιδία με συγκεκριμένες ακολουθίες αμινοξέανων, χρησιμοποιούμε τη μέθοδο Fmoc-SPPS (σύνθεση πεπτιδίων σε κατάσταση ολιγών). Κατά τη σύνθεση σε κατάσταση ολιγών, μια ομάδα που μπορεί να αντιδράει με ομάδες καρβοξυλικού οξέος εισαγόταν στον ολικό φορέα για να αντιδράσει με το αμινο-προστατευμένο αμινό, καθιστώντας το πρώτο αμινοξέανο δεμένο στο ρεζίν. Η αντίδραση ολοκληρώνεται από το άκρο C προς το άκρο N για να ολοκληρωθεί η σύνθεση της στόχου ακολουθίας πεπτιδίου.

Μέθοδοι Καθαρισμού:

Η εταιρεία μας χρησιμοποιεί ένα σύστημα υψηλής απόδοσης υγρής χρωματογράφησης με κώλο προετοιμασίας C18 αντιστρόφου για διαχώριση και καθαρισμό, ακολουθώντας αυτά τα βήματα:

αναγνώριση: Πάρτε μια μικρή ποσότητα απλωμένου πεπτιδίου για μαζική φασματοσκοπία προκειμένου να επιβεβαιωθεί η παρουσία του στόχου πεπτιδίου (αν ναι, επιβεβαιώστε το χρόνο κράτησής του στο κώλο C18 μέσω αναλυτικής χρωματογραφίας. Αν όχι, επανασυνταξτείτε το απλωμένο πεπτιδίο).

Διάλυση: Χρησιμοποιήστε ουλτρωθαλάσσια βοήθεια για διάλυση, επιλέγοντας συνήθως 90% νερό + 10% ακρονιτριλ (ή μεθανόλη ή ισοπροπανόλη). Για δύσκολη διαλυσιμότητα, προσθέστε κατάλληλο οξικό ή τριφλουοροξεικό για να βοηθήσετε στη διάλυση αν η ακολουθία έχει μεγαλύτερη αναλογία βασικών αμινοξέανων. Προσθέστε κατάλληλο νερό αμμωνίου αν κυριαρχούν τα οξύα αμινοξέα. Χρησιμοποιήστε DMSO (διμεθυλ σουλφοξιν) αν κυριαρχούν τα υδροφοβικά αμινοξέα.

Φιλτράρισμα: Φιλτράρετε το διαλυμένο απλωμένο προϊόν μέσω μιας μεμβράνης φιλτράρισμα 0.45 µm (για να προστατεύσετε το κώλο προετοιμασίας) για μεταγενέστερη χρήση.

Φόρτωση δείγματος: Χρησιμοποιήστε το υψηλής επιδόσεως υγρό σύστημα προετοιμασίας για να εισάγετε το υγρό δείγμα στην στήλη προετοιμασίας.

Απόσταξη: Με βάση τον παράγωγο απόσταξης που ορίστηκε στην ένδειξη 1), χωρίστε τα ρυπαντικά από τα πεπτίδια χρησιμοποιώντας τις διαφορές πολαρότητας των πεπτιδίων διαφορετικής μήκους.

Προβλέψεις της χρήσης ενός συστήματος υψηλής επιδόσεως υγρής χρωματογραφίας:

Υψηλότερη απόδοση από άλλες μεθόδους χρωματογραφίας. Η στήλη προετοιμασίας C18 που χρησιμοποιείται έχει υψηλή αποδοτικότητα στήλης, μεγάλη διάρκεια ζωής και καλή αναπαραγωγικότητα, επιτρέποντας επανειλημμένη χρήση. Γρήγορη ταχύτητα και υψηλή αποτελεσματικότητα, με κάθε δείγμα να καθαρίζεται σε λεπτά ή δεκάδες λεπτά. Ευρεία εφαρμογή και εξελιγμένη τεχνολογία αντίστροφης φάσης χρωματογραφίας, προσφέροντας καλή επιλεκτικότητα για διάφορους τύπους οργανικών συντελεστών.

Καθαρισμός και λυοφιλισμός απλών πεπτιδίων:

Το ασύδετο πεπτίδιο χωρίζεται και καθαρίζεται με τη χρήση ενός συστήματος υψηλής απόδοσης υγρής χρωματογραφίας και αναλύεται για καθαρότητα με υψηλή απόδοση υγρής χρωματογραφίας (HPLC) για να αποκτηθούν οι προσδιορισμένες υγρές συστατικές.

Σύστημα Περιστροφικής Αποψύχησης: Το προσδιορισμένο υγρό συστατικό υποβάλλεται σε κενούργεια για θερμανση και αφαιρείται εύκολα υφιστάμενα οργανικά διαλύματα, τελικά αποκτώντας λύση που περιέχει το στόχο πεπτίδιο, το οποίο τοποθετείται σε κρυοθήκη για να δημιουργηθούν στερεά κρύσταλλα πάγου.

Σύστημα Κρυοανατροπής: Οι περιέχουσες που φέρουν τα στερεά κρύσταλλα πάγου τοποθετούνται στο πιάτο ή το κενούργειας άνοιγμα του συστήματος κρυοανατροπής. Σε κενούργεια, το προϊόν πεπτιδίου υποβάλλεται σε υποδοχή, τελικά παράγοντας στερεό πούδρα πεπτιδίου.

Τα κρύσταλλα πεπτιδίου είναι έτοιμα για κρυοανατροπή στο σύστημα κρυοανατροπής.