Purificación de péptidos

Para obtener péptidos con secuencias de aminoácidos específicas utilizamos el método Fmoc-SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida).

Antecedentes:

Los péptidos son sustancias bioactivas relacionadas con diversas funciones celulares en los organismos biológicos. Su estructura molecular se encuentra entre aminoácidos y proteínas, constituidas por múltiples aminoácidos dispuestos en un orden específico y unidos por enlaces peptídicos (—NH—CO—). Los compuestos formados por la condensación por deshidratación de dos moléculas de aminoácidos se denominan dipéptidos, de manera similar, existen tripéptidos, tetrapéptidos, pentapéptidos, etc., hasta nonapéptidos. Los compuestos formados típicamente de 10 a 100 moléculas de aminoácidos mediante condensación por deshidratación se denominan polipéptidos.

Los servicios personalizados de péptidos se refieren a la síntesis de péptidos según los requisitos del cliente, como secuencia, pureza, peso molecular y contenido de sal, para satisfacer necesidades específicas. El peso molecular se confirma mediante espectrometría de masas para garantizar la exactitud de la MS bruta, seguido de la purificación mediante un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento, luego la concentración y la liofilización para obtener el polvo peptídico fino.

Para obtener péptidos con secuencias de aminoácidos específicas utilizamos el método Fmoc-SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida). Durante la síntesis en fase sólida, se introduce un grupo capaz de reaccionar con grupos carboxílicos en el portador en fase sólida para reaccionar con el amino protegido, anclando el primer aminoácido a la resina. Luego, la reacción se completa desde el extremo C al extremo N para completar la síntesis de la secuencia del péptido objetivo.

Métodos de purificación:

Nuestra empresa utiliza un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento con una columna preparatoria C18 inversa para la separación y purificación, siguiendo estos pasos:

Identificación:Tome una pequeña cantidad de péptido crudo para espectrometría de masas para confirmar la presencia del péptido objetivo (en caso afirmativo, confirme su tiempo de retención en la columna C18 mediante cromatografía analítica; en caso contrario, resintetice el péptido crudo).

Disolución:Utilice asistencia ultrasónica para la disolución, seleccionando normalmente 90 % de agua + 10 % de acetonitrilo (metanol o isopropanol). Para solubilidad difícil, agregue ácido acético o ácido trifluoroacético apropiado para ayudar a la disolución si la secuencia tiene una mayor proporción de aminoácidos básicos; agregue agua con amoníaco apropiado si predominan los aminoácidos ácidos. Utilice DMSO (dimetilsulfóxido) si predominan los aminoácidos hidrófobos.

Filtración:Filtrar el producto crudo disuelto a través de una membrana filtrante de 0.45 µm (para proteger la columna preparatoria) para su uso posterior.

Carga de muestra:Utilice el sistema preparatorio de líquidos de alto rendimiento para introducir la muestra líquida en la columna preparatoria.

Elución:Según el gradiente de elución determinado en el paso 1), separe las impurezas de los péptidos utilizando las diferencias de polaridad de los péptidos de diferente longitud.

Ventajas de utilizar un sistema de cromatografía líquida de alta resolución:

Mayor resolución que otros métodos de cromatografía; la columna preparatoria C18 utilizada tiene una alta eficiencia de columna, una larga vida útil y buena reproducibilidad, lo que permite un uso repetido; velocidad rápida y alta eficiencia, con cada muestra purificada en minutos o decenas de minutos; Amplia aplicación y tecnología madura de cromatografía de fase inversa, que ofrece buena selectividad para varios tipos de compuestos orgánicos.

Purificación y liofilización de péptidos crudos:

El péptido crudo se separa y purifica usando un sistema preparatorio de cromatografía líquida de alto rendimiento y se analiza su pureza usando un cromatógrafo líquido de alto rendimiento (HPLC) para obtener los componentes líquidos calificados.

Sistema de evaporación rotatoria: el componente líquido calificado se somete a calentamiento al vacío para eliminar solventes orgánicos fácilmente volátiles, obteniendo finalmente una solución que contiene el péptido objetivo, que luego se coloca en un congelador para formar cristales de hielo sólidos.

Sistema de liofilización: los recipientes que contienen cristales de hielo sólidos se colocan en la bandeja del liofilizador o en el puerto de vacío. En un entorno de vacío, el producto peptídico se sublima y, en última instancia, produce un polvo de péptido sólido.

Los cristales de péptidos están listos para la liofilización en el liofilizador.