Purificación de péptidos

Para obtener péptidos con secuencias específicas de aminoácidos, utilizamos el método Fmoc-SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida).

Antecedentes:

Los péptidos son sustancias bioactivas relacionadas con varias funciones celulares en los organismos biológicos. Su estructura molecular se encuentra entre los aminoácidos y las proteínas, consistiendo en múltiples aminoácidos dispuestos en un orden específico y unidos por enlaces peptídicos (—NH—CO—). Los compuestos formados por la condensación deshidratada de dos moléculas de aminoácidos se llaman dipeptidos, de manera similar, existen tripeptidos, tetrapeptidos, pentapeptidos, y así sucesivamente, hasta nonapeptidos. Los compuestos típicamente formados por 10 a 100 moléculas de aminoácidos mediante condensación deshidratada se llaman polipéptidos.

Los servicios de péptidos personalizados se refieren a la síntesis de péptidos según los requisitos del cliente, como la secuencia, pureza, peso molecular y contenido de sal, para satisfacer necesidades específicas. El peso molecular se confirma mediante espectrometría de masas para asegurar la corrección de la MS cruda, seguido de purificación utilizando un sistema de cromatografía líquida de alta rendimiento, luego concentración y liofilización para obtener el polvo de péptido fino.

Para obtener péptidos con secuencias específicas de aminoácidos, utilizamos el método Fmoc-SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida). Durante la síntesis en fase sólida, se introduce un grupo capaz de reaccionar con grupos carboxílicos en el soporte sólido para reaccionar con el amino protegido, anclando el primer aminoácido a la resina. La reacción se completa desde el extremo C hasta el extremo N para completar la síntesis de la secuencia de péptido objetivo.

Métodos de purificación:

Nuestra empresa utiliza un sistema de cromatografía líquida de alta rendimiento con una columna preparativa C18 inversa para la separación y purificación, siguiendo estos pasos:

identificación: Tome una pequeña cantidad de péptido crudo para espectrometría de masas con el fin de confirmar la presencia del péptido objetivo (si es así, confirme su tiempo de retención en la columna C18 mediante cromatografía analítica; si no, resintetice el péptido crudo).

Disolución: Utilice la asistencia ultrasónica para disolver, generalmente seleccionando 90% agua + 10% acetonitrilo (metanol o isopropanol). Para solubilidades difíciles, agregue ácido acético o trifluoroacético apropiado para ayudar a la disolución si la secuencia tiene una proporción más alta de aminoácidos básicos; agregue agua amoniacal apropiada si los aminoácidos ácidos predominan. Use DMSO (dimetilsulfóxido) si los aminoácidos hidrofóbicos predominan.

Filtración: Filtre el producto crudo disuelto a través de una membrana filtrante de 0.45 µm (para proteger la columna preparativa) para su uso posterior.

Carga de muestra: Utilice el sistema de preparación líquida de alto rendimiento para introducir la muestra líquida en la columna de preparación.

Elución: Basado en el gradiente de elución determinado en el paso 1), separe las impurezas de los péptidos utilizando las diferencias de polaridad de péptidos de longitud variable.

Ventajas de usar un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento:

Mayor resolución que otros métodos de cromatografía; la columna preparativa C18 utilizada tiene alta eficiencia de columna, larga vida útil y buena reproducibilidad, lo que permite su uso repetido; velocidad rápida y alta eficiencia, con cada muestra purificada en minutos o decenas de minutos; amplia aplicación y tecnología madura de cromatografía de fase inversa, ofreciendo buena selectividad para diversos tipos de compuestos orgánicos.

Purificación y liofilización de péptidos crudos:

El péptido crudo se separa y purifica utilizando un sistema preparativo de cromatografía líquida de alta rendimiento y se analiza la pureza utilizando un cromatógrafo líquido de alta rendimiento (HPLC) para obtener los componentes líquidos cualificados.

Sistema de evaporación rotatoria: El componente líquido cualificado se somete a calentamiento bajo vacío para eliminar los disolventes orgánicos volátiles, obteniendo finalmente una solución que contiene el péptido objetivo, la cual se coloca en un congelador para formar cristales de hielo sólidos.

Sistema de liofilización: Los recipientes que contienen los cristales de hielo sólidos se colocan en la bandeja o puerto de vacío de la liofilizadora. En un entorno de vacío, el producto péptido se sublima, obteniendo finalmente polvo de péptido sólido.

Los cristales péptidos están listos para la liofilización en la liofilizadora.