Peptidi-puhdistus

Tehdäksemme peptidiит, jotka sisältävät tiettyjä aminohапatomerkkijonoja, käytämme Fmoc-SPPS-menetelmää (kiinteän fasen peptidisynthesi).

Tausta:

Peptidit ovat bioaktiivisia aineita, jotka liittyvät moniin solufunktioihin biologisissa organismieissä. Niiden molekyylioppi sijaitsee aminohappojen ja proteiinien välissä, koostuen useista aminohapeista, jotka on järjestetty tiettyjen järjestyksessä ja joita yhdistää peptidipito (—NH—CO—). Kaksi aminohappimolekyylin vettien poistumisen seurauksena muodostuvia yhdistymiä kutsutaan dipeptideiksi, samalla tavalla on olemassa tripeptideja, tetrapeptideja, pentapeptideja ja niin edelleen, jopa nonapeptideihin. Yleensä 10:sta tai useammasta aminohappimolekyylistä vettien poistumisen seurauksena muodostuvia yhdistymiä kutsutaan polypeptideiksi.

Peptidiyhteenosoituspalvelut viittaavat peptidien synteesiin asiakkaan vaatimusten mukaisesti, kuten sekvenssien, puhtauden, molekyylikokon ja suolapitoisuuden osalta, jotta täytetään tiettyjä tarpeita. Molekyylikokoa vahvistetaan massaspektrometrian avulla varmistaakseen alkuperäisen MS:n oikeellisuus, jonka jälkeen se puhdastetaan korkean suorituskyvyn nestesiltausjärjestelmällä, keskittää ja lyöfioidaan saadakseen hienon peptidi-jauhelen.

Tehdäksemme peptidit tietyillä aminohapposekvensseillä käytämme Fmoc-SPPS-menetelmää (kiinteän fasen peptidiyhteenosoitus). Kiinteän fasen syntyneessä reaktioon otetaan kiinteään fasoon kykyinen ryhmä, joka reagoi karboksyyryhmiin, jotta se voi reagoida ammoinnilla suojatun aminohapon kanssa, ankaroimalla ensimmäisen aminohapon resiiniin. Reaktio suoritetaan sitten C-loppusta N-loppuun saadakseen kohdepeptidi-sekvenssin synteesin valmiiksi.

Puhdastusmenetelmät:

Yrityksemme käyttää korkean suorituskyvyn nestesarakasta järjestelmää käänteisellä C18 valmistussarakeella erotteluun ja puhdistukseen seuraavien vaiheiden mukaan:

Tunnistus: Ota vähän raa'aa peptidia massaspectrometriaan varmistaaksesi kohdepeptidin läsnäolo (jos kyllä, vahvista sen kiintyemisaika C18-sarakkeessa analyysisarakastuksen kautta; jos ei, resynteesoi raa'an peptidi uudelleen).

Dissoluutio: Käytä ääniulvollista avustusta dissoluutiolle, yleensä valitsemalla 90 % vettä + 10 % aseetoniihde (tai metanol tai isopropanoli). Vaikeasti dissoluutoituvissa tapauksissa lisää sopivaa etaneea tai trifluoretaanee apuna dissoluution saamiseksi, jos sekvenssissä on suuri osuus perusaineisiin kuuluvia aminohappoja; lisää sopivaa ammiakkavesi, jos hapea-aminohapot ovat enemmistössä. Käytä DMSO:ta (dimetyylisulfookiida), jos hydrofobiset aminohapot ovat enimmäksissä.

Suodatus: Suoleta dissoluoitunut raaka tuote 0,45 µm suodatinlevystä läpi (suojatakseen valmistussarake) myöhemmän käytön varalle.

Näyte ladattu: Käytä korkean suorituskyvyn nestesuodatusjärjestelmää nestemäisen näytteen syöttämiseen suodatussarjuun.

Eluoituminen: Perustuen askel 1) määräämiseen eluoitumusgradienttiin, erota saasteet peptidit välisestä erottelemisesta käyttämällä polaarisuuseroja vaihtelevan pituisia peptiisejä.

Edut korkean suorituskyvyn nestesuodatuksen käytöstä:

Suurempi resoluutio kuin muilla kromatografiamenetelmillä; C18-suodatussarju, jota käytetään, on tehokas, sillä se tarjoaa pitkän käyttöelämän ja hyvät toistoehdot, mikä mahdollistaa moninkertainen käyttö; nopea ja tehokas, jossa kukin näyte puretaan minuuteissa tai kymmenessä minuutissa; laaja soveltuvuus ja kypsä teknologia käänteiskromatografialla, joka tarjoaa hyvät valintakriteerit erilaisille orgaanisille yhdisteille.

Raaka-peptidi puhdistus ja lyofyys:

Raa'asta peptidi eriytetään ja puhdastetaan korkean suorituskyvyn nestesekoittimen avulla, ja sen puhtautta analysoidaan korkean suorituskyvyn nestesekoittimella (HPLC) saadakseen laadukkaat nestekoostumat.

Pyörivä hillointijärjestelmä: Laadukas nestekoostuma jätetään vakuumilmmennettäväksi poistaakseen helposti hajoavia orgaanisia ratkaisimia, mikä antaa lopulta konsentraatin, joka sisältää kohdepeptidin. Se sijoitetaan sitten jääkaappiin muodostaakseen kiinteät jäähienet.

Jääkuivattajärjestelmä: Kiinteät jäähienet asetetaan jääkuivattajan alustalle tai vakuumiporttiin. Vakuumiympäristössä peptidi tuhoutuu sublimoinnin kautta, mikä johtaa lopulta kiinteään peptidi-jauheeseen.

Peptidi-hienet ovat valmiita jääkuivatuksen käyttöön jääkuivattajassa.