Purification des peptides

Pour obtenir des peptides avec des séquences spécifiques d'acides aminés, nous utilisons la méthode Fmoc-SPPS (synthèse peptidique en phase solide).

Contexte :

Les peptides sont des substances bioactives liées à diverses fonctions cellulaires chez les organismes biologiques. Leur structure moléculaire se situe entre les acides aminés et les protéines, composée de plusieurs acides aminés disposés dans un ordre spécifique et liés par des liaisons peptidiques (—NH—CO—). Les composés formés par la condensation par déshydratation de deux molécules d'acides aminés sont appelés dipeptides, de même, il existe des tripeptides, tétrapéptides, pentapeptides, et ainsi de suite, jusqu'aux nonapéptides. Les composés généralement constitués de 10 à 100 molécules d'acides aminés par condensation par déshydratation sont appelés polypeptides.

Les services de synthèse de peptides sur mesure consistent en la fabrication de peptides selon les exigences du client, telles que la séquence, la pureté, le poids moléculaire et le contenu en sel, afin de répondre à des besoins spécifiques. Le poids moléculaire est confirmé par spectrométrie de masse pour garantir l'exactitude du MS brut, puis suit une purification par un système de chromatographie liquide haute performance, suivi d'une concentration et d'une lyophilisation pour obtenir la poudre de peptide fine.

Pour obtenir des peptides avec des séquences spécifiques d'acides aminés, nous utilisons la méthode Fmoc-SPPS (synthèse de peptides en phase solide). Lors de la synthèse en phase solide, un groupe capable de réagir avec des groupes carboxyles est introduit sur le support en phase solide pour réagir avec l'acide aminé protégé au niveau de l'amino, ancrant ainsi le premier acide aminé à la résine. La réaction se termine ensuite de la fin C à la fin N pour compléter la synthèse de la séquence peptidique cible.

Méthodes de purification :

Notre entreprise utilise un système de chromatographie en phase liquide haute performance avec une colonne préparative C18 inversée pour la séparation et la purification, en suivant ces étapes :

identification : Prendre une petite quantité de peptide brut pour l'analyse par spectrométrie de masse afin de confirmer la présence du peptide cible (si oui, confirmez son temps de rétention dans la colonne C18 via la chromatographie analytique ; si non, resynthétisez le peptide brut).

Dissolution : Utiliser une assistance ultrasonore pour la dissolution, en choisissant généralement 90 % d'eau + 10 % d'acétonitrile (méthanol ou isopropanol). Pour des problèmes de solubilité, ajouter de l'acide acétique ou de l'acide trifluoroacétique pour aider à la dissolution si la séquence contient une proportion élevée d'acides aminés basiques ; ajouter de l'ammoniaque si les acides aminés acides sont prédominants. Utilisez le DMSO (diméthylsulfoxyde) si les acides aminés hydrophobes sont prédominants.

Filtration: Filtrer le produit brut dissous à travers une membrane filtre de 0,45 µm (pour protéger la colonne préparative) pour une utilisation ultérieure.

Chargement de l'échantillon : Utilisez le système de préparation liquide haute performance pour introduire l'échantillon liquide dans la colonne de préparation.

Élution : Sur la base du gradient d'élution déterminé à l'étape 1), séparez les impuretés des peptides en utilisant les différences de polarité des peptides de longueurs variées.

Avantages de l'utilisation d'un système de chromatographie liquide haute performance :

Résolution plus élevée que les autres méthodes de chromatographie ; la colonne préparative C18 utilisée a une efficacité de colonne élevée, une durée de vie longue et une bonne reproductibilité, permettant une utilisation répétée ; vitesse rapide et efficacité élevée, avec chaque échantillon purifié en quelques minutes ou dizaines de minutes ; application large et technologie mature de la chromatographie en phase inverse, offrant une bonne sélectivité pour divers types de composés organiques.

Purification et lyophilisation des peptides bruts :

Le peptide brut est séparé et purifié à l'aide d'un système préparatoire de chromatographie liquide à haute performance, puis analysé pour vérifier sa pureté à l'aide d'une chromatographie liquide à haute performance (HPLC) afin d'obtenir les composants liquides qualifiés.

Système d'évaporation rotative : le composant liquide qualifié est soumis à un chauffage sous vide pour éliminer les solvants organiques volatils, obtenant finalement une solution contenant le peptide cible, qui est ensuite placée dans un congélateur pour former des cristaux de glace solides.

Système de lyophilisation : Les récipients contenant les cristaux de glace solide sont placés sur la plateau du lyophilisateur ou le port sous vide. Dans un environnement sous vide, le produit peptide subit une sublimation, aboutissant finalement à une poudre de peptide solide.

Les cristaux de peptide sont prêts pour la lyophilisation dans le lyophilisateur.