Purification des peptides

Pour obtenir des peptides avec des séquences d'acides aminés spécifiques, nous utilisons la méthode Fmoc-SPPS (solid-phase peptide synthesis).

Contexte:

Les peptides sont des substances bioactives liées à diverses fonctions cellulaires des organismes biologiques. Leur structure moléculaire se situe entre les acides aminés et les protéines, constituées de plusieurs acides aminés disposés dans un ordre spécifique et liés par des liaisons peptidiques (-NH-CO-). Les composés formés par la condensation par déshydratation de deux molécules d'acides aminés sont appelés dipeptides. De même, il existe des tripeptides, des tétrapeptides, des pentapeptides, etc., jusqu'aux nonapeptides. Les composés généralement constitués de 10 à 100 molécules d’acides aminés par condensation par déshydratation sont appelés polypeptides.

Les services personnalisés de peptides font référence à la synthèse de peptides en fonction des exigences du client, telles que la séquence, la pureté, le poids moléculaire et la teneur en sel, pour répondre à des besoins spécifiques. Le poids moléculaire est confirmé par spectrométrie de masse pour garantir l'exactitude du MS brut, suivi d'une purification à l'aide d'un système de chromatographie liquide haute performance, puis d'une concentration et d'une lyophilisation pour obtenir la fine poudre de peptide.

Pour obtenir des peptides avec des séquences d'acides aminés spécifiques, nous utilisons la méthode Fmoc-SPPS (solid-phase peptide synthesis). Lors de la synthèse en phase solide, un groupe capable de réagir avec des groupes carboxyliques est introduit sur le support en phase solide pour réagir avec l'amino amino-protégé, ancrant le premier acide aminé à la résine. La réaction est ensuite complétée de l’extrémité C à l’extrémité N pour achever la synthèse de la séquence peptidique cible.

Méthodes de purification :

Notre société utilise un système de chromatographie liquide haute performance avec une colonne préparatoire inversée C18 pour la séparation et la purification, en suivant ces étapes :

Identification:Prélever une petite quantité de peptide brut pour la spectrométrie de masse afin de confirmer la présence du peptide cible (si oui, confirmer son temps de rétention dans la colonne C18 par chromatographie analytique ; si non, resynthétiser le peptide brut).

Dissolution:Utilisez l’assistance ultrasonique pour la dissolution, en sélectionnant généralement 90 % d’eau + 10 % d’acétonitrile (méthanol ou isopropanol). En cas de solubilité difficile, ajoutez de l'acide acétique ou de l'acide trifluoroacétique approprié pour faciliter la dissolution si la séquence contient une proportion plus élevée d'acides aminés basiques ; ajouter de l'eau ammoniaquée appropriée si les acides aminés acides sont prédominants. Utilisez du DMSO (diméthylsulfoxyde) si les acides aminés hydrophobes sont prédominants.

Filtration:Filtrer le produit brut dissous à travers une membrane filtrante de 0.45 µm (pour protéger la colonne préparatoire) pour une utilisation ultérieure.

Chargement de l'échantillon :Utilisez le système de préparation de liquide haute performance pour introduire l’échantillon liquide dans la colonne préparatoire.

Élution :Sur la base du gradient d’élution déterminé à l’étape 1), séparez les impuretés des peptides en utilisant les différences de polarité des peptides de différentes longueurs.

Avantages de l’utilisation d’un système de chromatographie liquide haute performance :

Résolution supérieure à celle des autres méthodes de chromatographie ; la colonne préparatoire C18 utilisée présente une efficacité de colonne élevée, une longue durée de vie et une bonne reproductibilité, permettant une utilisation répétée ; vitesse rapide et haute efficacité, chaque échantillon étant purifié en quelques minutes ou dizaines de minutes ; large application et technologie mature de chromatographie en phase inverse, offrant une bonne sélectivité pour divers types de composés organiques.

Purification et lyophilisation des peptides bruts :

Le peptide brut est séparé et purifié à l'aide d'un système préparatoire de chromatographie liquide haute performance et analysé pour sa pureté à l'aide d'un chromatographe liquide haute performance (HPLC) pour obtenir les composants liquides qualifiés.

Système d'évaporation rotatif : le composant liquide qualifié est soumis à un chauffage sous vide pour éliminer les solvants organiques facilement volatils, obtenant finalement une solution contenant le peptide cible, qui est ensuite placée dans un congélateur pour former des cristaux de glace solides.

Système de lyophilisation : les récipients contenant les cristaux de glace solides sont placés sur le plateau du lyophilisateur ou sur le port sous vide. Dans un environnement sous vide, le produit peptidique est sublimé, produisant finalement une poudre peptidique solide.

Les cristaux peptidiques sont prêts à être lyophilisés au lyophilisateur.