Čišćenje peptida

Da bismo dobili peptide s specifičnim nizovima aminokiselina, koristimo Fmoc-SPPS metodu (tvarinsko sinteze peptida).

Pozadina:

Peptidi su biološki aktivne tvari povezane s različitim staničnim funkcijama u biološkim organizmima. Njihova molekularna struktura nalazi se između aminokiselina i proteina, sastoji se od više aminokiselina raspoređenih u određenom redoslijedu i povezanih peptidskim veznama (—NH—CO—). Složenine koje nastaju dehidracijskom kondenzacijom dvije aminokiselinske molekule nazivaju se dipeptidi, slično tome postoje tripeptidi, tetrapeptidi, pentapeptidi i tako dalje, sve do nonapeptida. Složenine obično sastavljene od 10 do 100 aminokiselinskih molekula putem dehidracijske kondenzacije nazivaju se polipeptidi.

Usluge prilagođenih peptida se odnose na sintezu peptida prema zahtjevima stranke, kao što su niz, čistoća, molekularna težina i sadržaj soli, kako bi se ispunile specifične potrebe. Molekularna težina se potvrđuje masnim spektrometrijom kako bi se osigurala točnost prikršnog MS-a, nakon čega slijedi očišćavanje pomoću sustava visoke učinkovite tekuće kromatografije, zatim koncentracija i liofilizacija kako bi se dobilo jake peptidske prašice.

Kako bismo dobili peptide s specifičnim nizovima aminokiselina, koristimo metodu Fmoc-SPPS (solidna-fazna sinteza peptida). Tijekom sintese u čvrstoj fazi na čvrstom nosaču uvodi se grupa koja može reagirati s karbonsim skupinama kako bi se spojila s aminozascitim aminokiselinom, čime se prva aminokiselina zakotvi na rezinu. Reakcija se zatim izvodi od C-kraja do N-kraja kako bi se dovršila sinteza ciljnog peptidskog niza.

Metode očišćavanja:

Naša tvrtka koristi sustav visoke-performantne tekuće kromatografije s obrnutim C18 pripremnim stupcem za odvajanje i očišćavanje, prateći sljedeće korake:

identifikacija: Uzmite malu količinu neobradjenog peptida za maseni spektar kako biste potvrdili prisutnost ciljnog peptida (ako je da, potvrdite njegov vrijeme zadržavanja u C18 stupcu putem analitičke kromatografije; ako nije, ponovno sintetizirajte neobradjeni peptid).

Dizolvanje: Koristite ultrazvučnu pomoć za dizolvanje, obično birajući 90% vode + 10% acetonitrila (metanol ili izopropanol). U slučaju teškog dizolvanja, dodajte odgovarajuće količine octe ili trifluorocte kako bi se olakšalo dizolvanje ako niz sadrži veći udio osnovnih aminokiselina; dodajte odgovarajuće količine vode s amonijem ako su prevaljujuće kiseline aminokiseline. Koristite DMSO (dimetilsulfoxid) ako su prevaljujuće hidrofobne aminokiseline.

Filtriranje: Filtrirajte dizolvani neobradjeni proizvod kroz membranu filtera od 0.45 µm (kako biste zaštitili pripremni stupac) za kasniju uporabu.

Učitavanje uzorka: Koristite visoko-performantni tečno-kemijski sustav za unos tečnog uzorka u pripremnu kolonu.

Eluciranje: Na temelju eluciranja gradijenta određenog u koraku 1), odvojite onesištaje od peptida pomoću polaritetskih razlika peptida različite duljine.

Prednosti korištenja visoko-performantnog tečno-kemijskog sustava:

Viša rezolucija od drugih metoda kromatografije; C18 pripremna kolona koja se koristi ima visoku učinkovitost kolone, duga trajnost i dobra reprodukcibilnost, što omogućuje ponovno korištenje; brzina i učinkovitost, s čišćenjem svakog uzorka u roku od nekoliko ili desetaka minuta; široka primjena i zrelo tehnologije obrnutofazne kromatografije, pružajući dobru selektivnost za različite vrste organskih spojeva.

Čišćenje i liofilizacija sirovih peptida:

Surovi peptid se odvaja i očišćuje pomoću sustava visoke učinkovitosti za pripremu tekućinske hromatografije, a analizira se na čistoću pomoću visokoučinkovite tekućinske hromatografije (HPLC) kako bi se dobili kvalificirani tekući sastojci.

Rotacijski evaporacijski sustav: Kvalificirani tekući sastojak se podvrgava vakuumsku topljenju kako bi se uklonili lako volatilni organski razjačivači, nakon čega se dobiva rješenje koje sadrži ciljni peptid, koji se zatim smješta u freezer kako bi se formirao čvrsti ledeni kristal.

Sustav za mroznu sušu: Spremnici s čvrstim ledanim kristalima stavljaju se na ploču mrozne suše ili vakuumski otvor. U vakuumskom okruženju peptidski proizvod se sublimira, što na kraju daje čvrstu peptidsku prašinu.

Peptidski kristali spremni su za mroznu sušu u uređaju za mroznу sušu.