Pročišćavanje peptida Hrvatska

Za dobivanje peptida sa specifičnim sekvencama aminokiselina koristimo Fmoc-SPPS (solid-phase peptide synthesis) metodu.

Pozadina:

Peptidi su bioaktivne tvari povezane s različitim staničnim funkcijama u biološkim organizmima. Njihova molekularna struktura nalazi se između aminokiselina i proteina, sastoje se od više aminokiselina poredanih određenim redoslijedom i povezanih peptidnim vezama (—NH—CO—). Spojevi koji nastaju dehidracijskom kondenzacijom dviju molekula aminokiselina nazivaju se dipeptidi, slično tome postoje tripeptidi, tetrapeptidi, pentapeptidi i tako dalje, sve do nonapeptida. Spojevi koji se tipično sastoje od 10 do 100 molekula aminokiselina dehidracijskom kondenzacijom nazivaju se polipeptidi.

Prilagođene usluge peptida odnose se na sintezu peptida na temelju zahtjeva kupaca, kao što su sekvenca, čistoća, molekularna težina i sadržaj soli, kako bi se zadovoljile specifične potrebe. Molekulska težina se potvrđuje spektrometrijom mase kako bi se osigurala ispravnost sirove MS, nakon čega slijedi pročišćavanje korištenjem sustava tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti, zatim koncentracija i liofilizacija kako bi se dobio fini peptidni prah.

Za dobivanje peptida sa specifičnim sekvencama aminokiselina koristimo Fmoc-SPPS (solid-phase peptide synthesis) metodu. Tijekom sinteze u čvrstoj fazi, skupina koja je sposobna reagirati s karboksilnim skupinama uvodi se na nosač u čvrstoj fazi kako bi reagirala s amino-zaštićenom aminokiselinom, pričvršćujući prvu aminokiselinu za smolu. Reakcija se zatim dovršava od C-kraja do N-kraja kako bi se dovršila sinteza ciljane peptidne sekvence.

Metode pročišćavanja:

Naša tvrtka koristi sustav tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti s reverznom C18 pripremnom kolonom za odvajanje i pročišćavanje, slijedeći ove korake:

Identifikacija:Uzmite malu količinu sirovog peptida za masenu spektrometriju kako biste potvrdili prisutnost ciljanog peptida (ako da, potvrdite njegovo vrijeme zadržavanja u koloni C18 analitičkom kromatografijom; ako nije, ponovno sintetizirajte sirovi peptid).

Otapanje:Koristite ultrazvučnu pomoć za otapanje, obično odabirom 90% vode + 10% acetonitrila (metanol ili izopropanol). Za tešku topljivost, dodajte odgovarajuću octenu kiselinu ili trifluoroctenu kiselinu kako biste pomogli otapanje ako sekvenca ima veći udio bazičnih aminokiselina; dodajte odgovarajuću amonijačnu vodu ako prevladavaju kisele aminokiseline. Koristite DMSO (dimetil sulfoksid) ako prevladavaju hidrofobne aminokiseline.

filtracija:Filtrirajte otopljeni sirovi produkt kroz filtersku membranu od 0.45 µm (za zaštitu pripremne kolone) za kasniju upotrebu.

Učitavanje uzorka:Upotrijebite sustav za pripremu tekućine visokih performansi za unos tekućeg uzorka u pripremnu kolonu.

Elucija:Na temelju gradijenta elucije određenog u koraku 1), odvojite nečistoće od peptida koristeći razlike polariteta peptida različite duljine.

Prednosti korištenja sustava tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti:

Veća razlučivost od ostalih metoda kromatografije; upotrijebljena pripremna kolona C18 ima visoku učinkovitost kolone, dug radni vijek i dobru ponovljivost, što omogućuje višekratnu upotrebu; velika brzina i visoka učinkovitost, pri čemu se svaki uzorak pročišćava u roku od nekoliko minuta ili desetaka minuta; široku primjenu i zrelu tehnologiju reverzno-fazne kromatografije, koja nudi dobru selektivnost za različite vrste organskih spojeva.

Pročišćavanje sirovog peptida i liofilizacija:

Sirovi peptid se odvaja i pročišćava pomoću preparativnog sustava za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti i analizira čistoću pomoću tekućinskog kromatografa visoke učinkovitosti (HPLC) kako bi se dobile kvalificirane tekuće komponente.

Sustav rotacijskog isparavanja: kvalificirana tekuća komponenta podvrgava se vakuumskom zagrijavanju kako bi se uklonila lako hlapljiva organska otapala, čime se konačno dobiva otopina koja sadrži ciljni peptid, koji se zatim stavlja u zamrzivač kako bi se formirali čvrsti kristali leda.

Sustav za sušenje zamrzavanjem: Spremnici koji drže čvrste kristale leda stavljaju se na ladicu za sušenje zamrzavanjem ili vakuumski otvor. U vakuumskom okruženju, peptidni produkt se sublimira, dajući u konačnici čvrsti peptidni prah.

Kristali peptida su spremni za sušenje zamrzavanjem u sušilici zamrzavanjem.