Purificazione dei Peptidi

Per ottenere peptidi con sequenze specifiche di aminoacidi, utilizziamo il metodo Fmoc-SPPS (sintesi peptidica a fase solida).

Contesto:

I peptidi sono sostanze bioattive legate a varie funzioni cellulari negli organismi biologici. La loro struttura molecolare si trova tra gli aminoacidi e le proteine, costituita da più aminoacidi disposti in un ordine specifico e legati da legami peptidici (—NH—CO—). I composti formati dalla condensazione per deidratazione di due molecole di aminoacidi vengono chiamati dipeptidi, similmente esistono tripeptidi, tetrapeptidi, pentapeptidi, e così via, fino a nonapeptidi. I composti tipicamente formati da 10 a 100 molecole di aminoacidi attraverso la condensazione per deidratazione vengono chiamati polipeptidi.

I servizi di sintesi di peptidi su misura si riferiscono alla produzione di peptidi in base alle richieste del cliente, come sequenza, purezza, peso molecolare e contenuto di sale, per soddisfare esigenze specifiche. Il peso molecolare viene confermato mediante spettrometria di massa per garantire la correttezza della MS grezza, seguito da purificazione utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alta prestazione, quindi concentrazione e liofilizzazione per ottenere la polvere di peptidi fine.

Per ottenere peptidi con sequenze specifiche di acidi amminici, utilizziamo il metodo Fmoc-SPPS (sintesi di peptidi a fase solida). Durante la sintesi a fase solida, viene introdotto un gruppo in grado di reagire con i gruppi carbossilici sul supporto solido per reagire con l'amino protetto, ancorando l'acido ammino iniziale alla resina. La reazione viene poi completata dall'estremità C all'estremità N per completare la sintesi della sequenza peptidica desiderata.

Metodi di purificazione:

La nostra azienda utilizza un sistema di cromatografia liquida ad alta prestazione con una colonna preparativa C18 inversa per la separazione e la purificazione, seguendo questi passaggi:

Identificazione: Prelevare una piccola quantità di peptido grezzo per l'analisi con spettrometria di massa per confermare la presenza del peptido di destinazione (se sì, confermare il suo tempo di ritardo nella colonna C18 tramite cromatografia analitica; se no, risintetizzare il peptido grezzo).

Solubilizzazione: Usare l'assistenza ultrasuonora per la solubilizzazione, selezionando tipicamente 90% acqua + 10% acetonitrile (metanolo o isopropanolo). Per solubilità difficoltosa, aggiungere acido acetico o trifluoroacetico appropriato per aiutare la solubilizzazione se la sequenza contiene una maggiore proporzione di aminoacidi basici; aggiungere acqua ammoniacale appropriata se prevale gli aminoacidi acidi. Usare DMSO (dimetilsolfossido) se prevale gli aminoacidi idrofobi.

Filtrazione: Filtrare il prodotto grezzo solubilizzato attraverso un filtro membranoso da 0,45 µm (per proteggere la colonna preparativa) per un uso successivo.

Caricamento del campione: Usa il sistema preparativo ad alta prestazione per introdurre il campione liquido nella colonna preparativa.

Eluizione: In base al gradiente di eluizione determinato nel passo 1), separa le impurità dai peptidi utilizzando le differenze di polarità dei peptidi di lunghezza variabile.

Vantaggi dell'uso di un sistema di cromatografia liquida ad alta prestazione:

Risoluzione superiore rispetto ad altri metodi di cromatografia; la colonna preparativa C18 utilizzata ha un'efficienza elevata, una durata lunga e una buona riproducibilità, permettendo l'uso ripetuto; velocità elevata ed efficienza, con ogni campione purificato in pochi minuti o decine di minuti; ampia applicazione e tecnologia matura della cromatografia a fase inversa, offrendo una buona selettività per vari tipi di composti organici.

Purificazione e liofilizzazione di peptidi grezzi:

Il peptideo grezzo viene separato e purificato utilizzando un sistema preparativo di cromatografia liquida ad alta prestazione e analizzato per la purezza utilizzando una cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) per ottenere i componenti liquidi qualificati.

Sistema di Evaporazione Rotativa: Il componente liquido qualificato viene sottoposto a riscaldamento sotto vuoto per rimuovere i solventi organici volatili, ottenendo infine una soluzione contenente il peptideo di destinazione, che viene poi posta in un congelatore per formare cristalli di ghiaccio solidi.

Sistema di Liofilizzazione: I contenitori contenenti i cristalli di ghiaccio solidi vengono posizionati sul vassoio o sulla porta del vuoto della liofilizzatrice. In un ambiente sotto vuoto, il prodotto peptidico viene sottrattato, producendo infine polvere peptidica solida.

I cristalli peptidici sono pronti per la liofilizzazione nella liofilizzatrice.