Peptidezuivering

Om peptiden met specifieke aminozuursequenties te verkrijgen, gebruiken we de Fmoc-SPPS-methode (solid-phase peptide synthesis).

Achtergrond:

Peptiden zijn bioactieve stoffen die verband houden met verschillende celfuncties in biologische organismen. Hun moleculaire structuur ligt tussen aminozuren en eiwitten, bestaande uit meerdere aminozuren die in een specifieke volgorde zijn gerangschikt en verbonden door peptidbindingen (—NH—CO—). Verbindingen gevormd door de dehydratiecondensatie van twee aminozuurmoleculen worden dipeptiden genoemd, op soortgelijke wijze zijn er tripeptiden, tetrapeptiden, pentapeptiden, enzovoort, tot nonapeptiden. Verbindingen die doorgaans bestaan uit 10 tot 100 aminozuurmoleculen door dehydratiecondensatie worden polypeptiden genoemd.

Peptide op maat diensten verwijzen naar de synthese van peptiden volgens klantenspecificaties, zoals sequentie, zuiverheid, moleculaire massa en zoutgehalte, om specifieke behoeften te voldoen. De moleculaire massa wordt bevestigd door massaspectrometrie om de juistheid van de ruwe MS te garanderen, gevolgd door reiniging met een hoogprestatie vloeistofchromatografie systeem, concentratie en lyofilisatie om het fijne peptide poeder te verkrijgen.

Om peptiden met specifieke aminozuursequenties te verkrijgen, gebruiken we de Fmoc-SPPS (solid-phase peptide synthese) methode. Tijdens de vastefase synthese wordt een groep die in staat is om te reageren met carboxylgroepen geïntroduceerd op de vastefase drager om te reageren met het aminobeschermde aminozuur, waardoor het eerste aminozuur aan de resin wordt vastgemaakt. De reactie wordt dan voltooid vanaf de C-eind tot het N-eind om de doelwitpeptide sequentie synthese te voltooien.

Reinigingsmethoden:

Ons bedrijf maakt gebruik van een hoogpresterend vloeistofchromatografisch systeem met een omgekeerde C18 preparatieve kolom voor scheiding en zuivering, volgens de volgende stappen:

Identificatie: Neem een kleine hoeveelheid ruwe peptiden voor massaspectrometrie om het aanwezig zijn van het doelpeptide te bevestigen (indien ja, bevestig de retentietijd in de C18-kolom via analytische chromatografie; indien nee, hersynthetiseer de ruwe peptide).

Oplossen: Gebruik ultrageluidshulp bij het oplossen, meestal wordt 90% water + 10% acetonitril (methanol of isopropanol) geselecteerd. Voor moeilijk oplosbaar, voeg passende azijnzuur of trifluoroazijnzuur toe om oplossing te helpen als de sequentie een hogere verhouding basale aminozuren heeft; voeg passende ammoniakwater toe als zuurderivaten van aminozuren predomineren. Gebruik DMSO (dimethyl sulfoxide) als hydrofobe aminozuren predomineren.

Filtratie: Filter het opgeloste ruwe product door een 0.45 µm filtermembran (om de preparatieve kolom te beschermen) voor later gebruik.

Monsteraanvoer: Gebruik het hoogprestatie vloeistofbereidingssysteem om de vloeistofschaal in de bereidingskolom in te voeren.

Elutie: Op basis van de elutiegraad bepaald in stap 1), scheiden de onreinigheden van peptiden door gebruik te maken van de polariteitsverschillen van peptiden van verschillende lengte.

Voordelen van het gebruik van een hoogprestatie vloeistofchromatografiesysteem:

Hoger oplosvermogen dan andere chromatografische methoden; de C18-bereidingskolom die wordt gebruikt heeft een hoge kolomefficiëntie, lange dienstleven en goede reproduceerbaarheid, wat herhaaldelijk gebruik mogelijk maakt; hoge snelheid en efficiëntie, met elk monster dat binnen enkele of tientallen minuten zuiver wordt gemaakt; brede toepassing en volwassen technologie van reverse-phase chromatografie, waardoor er goed selectiviteit is voor verschillende typen organische verbindingen.

Ruw peptidenzuivering en lyofilisatie:

Het ruwe peptid wordt gescheiden en gezuiverd met behulp van een preparatief systeem voor hoogprestatie vloeistofchromatografie en geanalyseerd op zuiverheid met een hoogprestatie vloeistofchromatograaf (HPLC) om de gekwalificeerde vloeistofcomponenten te verkrijgen.

Rotatiev verdampingsysteem: De gekwalificeerde vloeistofcomponent wordt onderworpen aan vacuümverwarming om gemakkelijk verdampte organische oplosmiddelen te verwijderen, waarna uiteindelijk een oplossing ontstaat die het doelpeptid bevat, die vervolgens in een vriezer wordt geplaatst om vast ijs te vormen.

Vriesdrogingsysteem: De bekertjes met de vast ijs worden op het vriesdrogingsplateau of de vacuümopening geplaatst. In een vacuümomgeving wordt het peptidproduct sublimatie onderworpen, wat uiteindelijk tot vaste peptidpoeder leidt.

De peptidkristallen zijn klaar om in de vriesdroger te worden behandeld.