Peptidrenseining

For å oppnå peptider med spesifikke aminosyrfølger, bruker vi Fmoc-SPPS-metoden (fastfasepeptidsyntese).

Bakgrunn:

Peptider er bioaktive stoffer som er knyttet til ulikezellulære funksjoner i biologiske organismer. Den molekylære strukturen ligger mellom aminosyurer og proteiner, bestående av flere aminosyurer oppstilt i en spesifikk rekkefølge og koblet sammen ved peptidbindinger (—NH—CO—). Sammensettelser dannet av dehydrasjonskondenseringen av to aminosyremolekyler kalles dipeptider, på samme måte finnes det tripeptider, tetrapeptider, pentapeptider, og så videre, opp til nonapeptider. Sammensettelinger typisk laget av 10 til 100 aminosyremolekyler gjennom dehydrasjonskondensering kalles polypeptider.

Peptidtilpasset tjenester referer til syntesen av peptider basert på kundekrav, som sekvens, renhet, molekylvekt og saltinnhold, for å oppfylle spesifikke behov. Molekylvekten bekreftes ved massespekstometri for å sikre riktig crude MS, deretter renses det ved bruk av et høyprestasjonsflytende kromatografisystem, kontrateseres og lyofiliseres for å få frem det fine peptidpulveret.

For å oppnå peptider med spesifikke aminosyresekvenser bruker vi Fmoc-SPPS-metoden (solid-fase-peptidsyntese). Under solid-fase-syntesen legges en gruppe som kan reagere med karboksylgrupper på solidfasen for å reagere med aminobeskyttede aminosyrer, ankerer den første aminosyren til resinen. Reaksjonen fullføres fra C-enden til N-enden for å fullføre syntesen av målpeptidsekvensen.

Reningsmetoder:

Vår bedrift bruker et høyprestasjonsflytningsskromatografisystem med en reversert C18 forberedelseskolonne for separasjon og renasjon, etter følgende trinn:

Identifisering: Ta en liten mengde rå peptid til masspektrometri for å bekrefte tilstedeværelsen av målpeptidet (hvis ja, bekreft dens holdetid i C18-kolonnen gjennom analytisk kromatografi; hvis ikke, resyntetiser den rå peptiden).

Opløsning: Bruk ultralyd-assistert opløsning, vanligvis ved å velge 90% vann + 10% aketonitril (metanol eller isopropanol). For vanskelig opløselighet, legg til passende mengde essigsyreblanding eller trifluoressigsyre for å hjelpe opløsningen hvis sekvensen har en høy andel basale aminosyrer; legg til passende mengde ammonia vann hvis syrlige aminosyrer dominerer. Bruk DMSO (dimetylsulfoxid) hvis hydrofobe aminosyrer dominerer.

Filtrering: Filter den opløste råproduktet gjennom en 0,45 µm filtermembran (for å beskytte forberedelseskolonnen) for senere bruk.

Prøveinnlasting: Bruk det høy ytelse væskeforberedelsessystemet til å sette inn væskeprøven i forberedelsessøjlen.

Elusjon: Basert på elusjonsgradienten som ble bestemt i trinn 1), adskil de ulike stoffene fra peptider ved å bruke polaritetsforskjellene mellom peptider av variabel lengde.

Fordeler med å bruke et system for høy ytelse væskechromatografi:

Høyere oppløsning enn andre chromatografimetoder; C18-forberedelsessøjlen som brukes har høy kolonneeffektivitet, lang tjenestelivstid og god gjentakbarhet, noe som tillater gjenbruk; rask fart og høy effektivitet, med hver prøve som renes innen minutter eller ti-minutters intervaller; bred anvendelse og moden teknologi for revers fase chromatografi, som gir god selektivitet for ulike typer organiske sammensettelser.

Rå-peptidrensa og lyofilisering:

Det råe peptidet separeres og renes ved hjelp av et høyprestasjonsvæskromatografisk forberedelsessystem og analyseres med hensyn på renhet ved bruk av en høyprestasjonsvæskromatograf (HPLC) for å oppnå de kvalifiserte væskekomponentene.

Rotasjonsevaporasjonssystem: Den kvalifiserte væskekomponenten utsettes for vakuumvarme for å fjerne lettforfruktbare organiske løsemidler, og man ender opp med en løsning som inneholder målpeptidet, som deretter plasseres i en fryser for å danne faste iskristaller.

Fryseparsesystem: Beholder med faste iskristaller plasseres på trayet eller vakuumporten til fryseparsen. I en vakuummiljø sublimeres peptidproduktet, og det endelige resultatet er fast peptippulver.

Peptidkristallene er klare for fryseparsing i fryseparsen.