Czyszczenie peptydów

Aby uzyskać peptydy o określonych sekwencjach aminokwasowych, używamy metody Fmoc-SPPS (synteza peptydów w fazie stałej).

tło:

Peptydy to substancje bioaktywne związane z różnymi funkcjami komórkowymi u organizmów żywych. Ich struktura molekularna znajduje się między kwasami aminowymi i białkami, składa się z wielu kwasów aminowych ułożonych w określonej kolejności i połączonych wiązaniami peptydowymi (—NH—CO—). Związki utworzone przez kondensację bezwodną dwóch cząsteczek kwasów aminowych nazywane są dipeptydami, podobnie istnieją tripeptydy, tetrapeptydy, pentapeptydy itd., aż do nonapeptydów. Związki zazwyczaj składające się z 10 do 100 cząsteczek kwasów aminowych połączone kondensacją bezwodną nazywane są polipeptydami.

Usługi w zakresie syntezy peptydów na zamówienie odnoszą się do produkcji peptydów zgodnie z wymaganiami klienta, takimi jak sekwencja, czystość, masa molowa i zawartość soli, aby spełnić określone potrzeby. Masa molowa potwierdzana jest przez spektrometrię masową w celu zapewnienia poprawności surowego MS, a następnie następuje oczyszczenie za pomocą systemu chromatografii ciekłej wysokiej wydajności, koncentracja i liofilizacja w celu uzyskania drobnego proszku peptydowego.

Aby uzyskać peptydy o określonych sekwencjach aminokwasowych, stosujemy metodę Fmoc-SPPS (synteza peptydów w fazie stałej). W trakcie syntezy w fazie stałej na nośniku stało fazowym wprowadzany jest grupa zdolna do reakcji z grupami karboksylowymi, która reaguje z chronionym aminokwasem amino, przyczepiając pierwszy aminokwas do rezyny. Reakcja jest kontynuowana od końcówki C do N, co pozwala na ukończenie syntezy docelowej sekwencji peptydowej.

Metody oczyszczania:

Nasza firma wykorzystuje system wysokowydajnej chromatografii ciekłej z odwracaną kolumną preparatywną C18 do oddzielenia i oczyszczenia, postępując według tych kroków:

identyfikacja: Weź małą ilość surowego peptydu do spektrometrii masowej, aby potwierdzić obecność docelowego peptydu (jeśli tak, potwierdź jego czas zatrzymania w kolumnie C18 za pomocą chromatografii analitycznej; jeśli nie, ponownie syntezyzuj surowy peptyd).

Dissolution: Użyj ultradźwięków do wspomagania rozpuszczania, zwykle wybierając 90% wody + 10% acetonitrylu (metanolu lub izopropylometanolu). W przypadku trudnego rozpuszczalności dodaj odpowiednią ilość octu glacialnego lub trifluorooctowego, aby ułatwić rozpuszczanie, jeśli sekwencja zawiera większą proporcję aminokwasów podstawowych; dodaj odpowiednią ilość wody amoniakowej, jeśli przeważają aminokwasy kwasowe. Użyj DMSO (dimetylowej sulfoksydyny), jeśli przeważają aminokwasy hydrofobowe.

Filtracja: Przefiltruj rozpuszczony produkt surowy przez membranę filtra o rozmiarze 0,45 µm (aby chronić kolumnę preparatywną) na późniejsze użytkowanie.

Ładowanie próbki: Użyj wysokowydajnego systemu przygotowawczego do wprowadzenia próby ciekłej do kolumny preparacyjnej.

Elucja: Na podstawie gradientu elucji określonego w kroku 1), oddziel nieczystości od peptydów, wykorzystując różnice polarności peptydów o różnych długościach.

Przewagi stosowania systemu chromatografii ciekłej wysokiej wydajności:

Wyższa rozdzielczość niż w innych metodach chromatografii; kolumna preparacyjna C18 używana ma wysoką wydajność kolumnową, długi okres użytkowania i dobrą powtarzalność, co umożliwia wielokrotne użycie; szybka prędkość i wysoka efektywność, z czystym przygotowaniem próbki w ciągu kilku minut lub dziesiątek minut; szerokie zastosowanie i dojrzała technologia chromatografii fazy odwrotnej, oferująca dobrą selektywność dla różnych rodzajów związków organicznych.

Oczyszczenie i liofilizacja surowych peptydów:

Pierwotny peptyd jest oddzielany ioczyszczany za pomocą systemu przygotowawczego chromatografii ciekłej wysokiej wydajności oraz analizowany pod kątem czystości za pomocą chromatografii ciekłej wysokiej wydajności (HPLC), aby uzyskać kwalifikowane składniki ciekłe.

System evaporacji obrotowej: Kwalifikowany składnik ciekły podlega ogrzewaniu w próżni w celu usunięcia łatwopalnych rozpuszczalników organicznych, ostatecznie uzyskując roztwór zawierający docelowy peptyd, który następnie umieszczany jest w zamrażarce, aby utworzyć stałe krystaliczne lodu.

System lyofilizacyjny: Pojemniki z zawartością stałych krystalicznych lodu umieszczane są na tacy lub portie próżniowego suszarki. W środowisku próżniowego produkt peptydowy ulega sublimacji, co kończy się ostatecznym uzyskaniem proszku peptydowego w stanie stałym.

Krystaliki peptydowe są gotowe do procesu suszarki w suszarce.