Purificação de Peptídeos

Para obter peptídeos com sequências específicas de aminoácidos, utilizamos o método Fmoc-SPPS (síntese de peptídeos em fase sólida).

Fundo:

Peptídeos são substâncias bioativas relacionadas a diversas funções celulares em organismos biológicos. Sua estrutura molecular fica entre aminoácidos e proteínas, consistindo de múltiplos aminoácidos dispostos em uma ordem específica e ligados por ligações peptídicas (—NH—CO—). Os compostos formados pela condensação por desidratação de duas moléculas de aminoácidos são chamados de dipeptídeos, da mesma forma, existem tripeptídeos, tetrapeptídeos, pentapeptídeos e assim por diante, até nonapeptídeos. Compostos normalmente feitos de 10 a 100 moléculas de aminoácidos por meio de condensação por desidratação são chamados de polipeptídeos.

Os serviços personalizados de peptídeos referem-se à síntese de peptídeos com base nos requisitos do cliente, como sequência, pureza, peso molecular e teor de sal, para atender a necessidades específicas. O peso molecular é confirmado por espectrometria de massa para garantir a exatidão do MS bruto, seguido de purificação usando um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho, depois concentração e liofilização para obter o peptídeo em pó fino.

Para obter peptídeos com sequências específicas de aminoácidos, utilizamos o método Fmoc-SPPS (síntese de peptídeos em fase sólida). Durante a síntese em fase sólida, um grupo capaz de reagir com grupos carboxílicos é introduzido no transportador de fase sólida para reagir com o amino protegido por amino, ancorando o primeiro aminoácido à resina. A reação é então completada da extremidade C até a extremidade N para completar a síntese da sequência peptídica alvo.

Métodos de purificação:

Nossa empresa utiliza um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência com coluna preparatória reversa C18 para separação e purificação, seguindo estas etapas:

Identificação:Pegue uma pequena quantidade de peptídeo bruto para espectrometria de massa para confirmar a presença do peptídeo alvo (se sim, confirme seu tempo de retenção na coluna C18 através de cromatografia analítica; se não, ressintetize o peptídeo bruto).

Dissolução:Use assistência ultrassônica para dissolução, normalmente selecionando 90% de água + 10% de acetonitrila (metanol ou isopropanol). Para solubilidade difícil, adicione ácido acético ou ácido trifluoroacético apropriado para auxiliar na dissolução se a sequência tiver uma proporção maior de aminoácidos básicos; adicione água com amônia apropriada se aminoácidos ácidos forem predominantes. Use DMSO (dimetilsulfóxido) se os aminoácidos hidrofóbicos forem predominantes.

Filtração:Filtre o produto bruto dissolvido através de uma membrana de filtro de 0.45 μm (para proteger a coluna preparatória) para uso posterior.

Carregamento de amostra:Use o sistema preparatório de líquido de alto desempenho para inserir a amostra líquida na coluna preparatória.

Eluição:Com base no gradiente de eluição determinado na etapa 1), separe as impurezas dos peptídeos usando as diferenças de polaridade dos peptídeos de comprimento variável.

Vantagens de usar um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho:

Resolução mais alta que outros métodos de cromatografia; a coluna preparatória C18 utilizada possui alta eficiência de coluna, longa vida útil e boa reprodutibilidade, permitindo uso repetido; velocidade rápida e alta eficiência, com cada amostra sendo purificada em minutos ou dezenas de minutos; ampla aplicação e tecnologia madura de cromatografia de fase reversa, oferecendo boa seletividade para diversos tipos de compostos orgânicos.

Purificação e liofilização de peptídeos brutos:

O peptídeo bruto é separado e purificado usando um sistema preparatório de cromatografia líquida de alto desempenho e analisado quanto à pureza usando um cromatógrafo líquido de alto desempenho (HPLC) para obter os componentes líquidos qualificados.

Sistema de Evaporação Rotativa: O componente líquido qualificado é submetido a aquecimento a vácuo para remover solventes orgânicos facilmente voláteis, obtendo-se finalmente uma solução contendo o peptídeo alvo, que é então colocado em um freezer para formar cristais de gelo sólidos.

Sistema de liofilização: Os recipientes contendo os cristais de gelo sólidos são colocados na bandeja do liofilizador ou na porta de vácuo. Num ambiente de vácuo, o produto peptídico é sublimado, produzindo finalmente um pó peptídico sólido.

Os cristais de peptídeo estão prontos para liofilização no liofilizador.