Purificação de Peptídeos

Para obter peptídeos com sequências específicas de aminoácidos, utilizamos o método Fmoc-SPPS (síntese de peptídeos em fase sólida).

Fundo:

Os peptídeos são substâncias bioativas relacionadas a várias funções celulares em organismos biológicos. Sua estrutura molecular está entre aminoácidos e proteínas, consistindo de múltiplos aminoácidos arranjados em uma ordem específica e ligados por ligações peptídicas (—NH—CO—). Compostos formados pela condensação desidrativa de duas moléculas de aminoácidos são chamados de dipeptídeos, da mesma forma, existem tripeptídeos, tetrapeptídeos, pentapeptídeos, e assim por diante, até nonapeptídeos. Compostos tipicamente formados por 10 a 100 moléculas de aminoácidos através da condensação desidrativa são chamados de polipeptídeos.

Os serviços de síntese de peptídeos personalizados referem-se à síntese de peptídeos com base nos requisitos do cliente, como sequência, pureza, peso molecular e conteúdo salino, para atender a necessidades específicas. O peso molecular é confirmado por espectrometria de massa para garantir a correção do MS bruto, seguido por purificação usando um sistema de cromatografia líquida de alta performance, depois concentração e liofilização para obter o pó de peptídeo fino.

Para obter peptídeos com sequências específicas de aminoácidos, utilizamos o método Fmoc-SPPS (síntese de peptídeos em fase sólida). Durante a síntese em fase sólida, um grupo capaz de reagir com grupos carboxílicos é introduzido no suporte sólido para reagir com o aminoácido protegido no amino, ancorando o primeiro aminoácido na resina. A reação é então concluída da extremidade C para a extremidade N para completar a síntese da sequência peptídica alvo.

Métodos de Purificação:

Nossa empresa utiliza um sistema de cromatografia líquida de alta performance com uma coluna preparativa reversa C18 para separação e purificação, seguindo estas etapas:

identificação: Pegue uma pequena quantidade de peptídeo bruto para espectrometria de massa para confirmar a presença do peptídeo alvo (se sim, confirme seu tempo de retenção na coluna C18 através de cromatografia analítica; se não, ressintetize o peptídeo bruto).

Dissolução: Use assistência ultrasônica para dissolução, normalmente selecionando 90% de água + 10% de acetona (metanol ou isopropanol). Para solubilidade difícil, adicione ácido acético ou trifluoroacético adequado para auxiliar na dissolução se a sequência tiver uma proporção maior de aminoácidos básicos; adicione água ammonia se aminoácidos ácidos forem predominantes. Use DMSO (dimetilsulfóxido) se aminoácidos hidrofóbicos forem predominantes.

Filtração: Filtre o produto bruto dissolvido através de uma membrana filtrante de 0,45 µm (para proteger a coluna preparativa) para uso posterior.

Carregamento da Amostra: Use o sistema preparativo de líquidos de alta performance para introduzir a amostra líquida na coluna preparativa.

Eluição: Com base no gradiente de eluição determinado no passo 1), separe as impurezas dos peptídeos utilizando as diferenças de polaridade de peptídeos de comprimentos variados.

Vantagens do uso de um sistema de cromatografia líquida de alta performance:

Maior resolução do que outros métodos de cromatografia; a coluna preparativa C18 utilizada possui alta eficiência de coluna, longa vida útil e boa reprodutibilidade, permitindo uso repetido; velocidade rápida e alta eficiência, com cada amostra sendo purificada em minutos ou dezenas de minutos; ampla aplicação e tecnologia madura da cromatografia de fase reversa, oferecendo boa seletividade para diversos tipos de compostos orgânicos.

Purificação e Liofilização de Peptídeos Brutos:

O peptídeo bruto é separado e purificado usando um sistema preparatório de cromatografia líquida de alta performance e analisado quanto à pureza usando uma cromatografia líquida de alta performance (HPLC) para obter os componentes líquidos qualificados.

Sistema de Evaporação Rotativa: O componente líquido qualificado é submetido a aquecimento sob vácuo para remover solventes orgânicos voláteis, obtendo-se por fim uma solução contendo o peptídeo alvo, que é então colocada em um congelador para formar cristais de gelo sólidos.

Sistema de Liofilização: recipientes contendo os cristais de gelo sólidos são colocados na bandeja ou porta-vácuo do liofilizador. Em um ambiente de vácuo, o produto peptídico é sublimado, resultando por fim em pó de peptídeo sólido.

Os cristais peptídicos estão prontos para a liofilização no liofilizador.