Очистка пептидов

Для получения пептидов с определёнными последовательностями аминокислот мы используем метод Fmoc-SPPS (синтез пептидов в твёрдой фазе).

Фон:

Пептиды являются биологически активными веществами, связанными с различными клеточными функциями в живых организмах. Их молекулярная структура находится между аминокислотами и белками, состоя из нескольких аминокислот, расположенных в определенном порядке и соединенных пептидными связями (—NH—CO—). Соединения, образованные дегидратационной конденсацией двух молекул аминокислот, называются ди펩тидами, аналогично существуют трипептиды, тетрапептиды, пентапептиды и так далее до нонапептидов. Соединения, обычно состоящие из 10 до 100 молекул аминокислот, образованных путем дегидратационной конденсации, называются полипептидами.

Услуги по синтезу пептидов подразумевают создание пептидов в соответствии с требованиями заказчика, такими как последовательность, чистота, молекулярный вес и содержание солей, для удовлетворения конкретных потребностей. Молекулярный вес подтверждается масс-спектрометрией для обеспечения правильности неочищенного MS, затем следует очистка с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии, концентрация и лиофилизация для получения высококачественного порошка пептида.

Для получения пептидов с определёнными аминокислотными последовательностями мы используем метод Fmoc-SPPS (синтез пептидов в твёрдой фазе). Во время синтеза в твёрдой фазе на носителе вводится группа, способная реагировать с карбоновыми группами, которая взаимодействует с аминозащищённым аминокислотным остатком, закрепляя первую аминокислоту на смоле. Затем реакция завершается от C-конца к N-концу для завершения синтеза целевой пептидной последовательности.

Методы очистки:

Наша компания использует систему высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой C18 для разделения и очистки, следуя этим шагам:

идентификация: Возьмите небольшое количество неочищенного пептида для масс-спектрометрического анализа, чтобы подтвердить наличие целевого пептида (если да, подтвердите его время удержания в колонке C18 через аналитическую хроматографию; если нет, повторно синтезируйте неочищенный пептид).

Диссоциация: Используйте ультразвуковую помощь для растворения, обычно выбирая 90% воды + 10% ацетонитрила (метанол или изопропанол). Для труднорастворимых случаев добавьте подходящее количество уксусной кислоты или трифторуксусной кислоты для помощи в растворении, если последовательность содержит высокий процент основных аминокислот; добавьте подходящее количество аммиачной воды, если преобладают кислые аминокислоты. Используйте ДМСО (диметилсульфоксид), если преобладают гидрофобные аминокислоты.

Фильтрация: Пропустите растворённый неочищенный продукт через мембрану фильтра размером 0.45 µм (для защиты подготовительной колонки) для дальнейшего использования.

Загрузка образца: Используйте высокоэффективную жидкостную предварительную систему для ввода жидкой пробы в подготовительную колонку.

Элюция: На основе элюционного градиента, определенного на шаге 1), разделите примеси от пептидов, используя различия полярности пептидов разной длины.

Преимущества использования высокоэффективной жидкостной хроматографической системы:

Выше разрешающая способность по сравнению с другими методами хроматографии; используемая колонка C18 имеет высокую эффективность, длительный срок службы и хорошую воспроизводимость, что позволяет использовать её многократно; высокая скорость и эффективность, при этом каждая проба очищается за минуты или десятки минут; широкое применение и зрелая технология обратной фазовой хроматографии, обеспечивающая хорошую селективность для различных типов органических соединений.

Очистка и лиофилизация неочищенных пептидов:

Сырой пептид отделяется и очищается с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии для приготовления и анализируется на чистоту с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ), чтобы получить квалифицированные жидкие компоненты.

Система вращательной эвапорации: квалифицированный жидкий компонент подвергается вакуумному нагреванию для удаления легковолатильных органических растворителей, в результате чего получается раствор, содержащий целевой пептид, который затем помещается в морозильную камеру для образования твердых кристаллов льда.

Система лиофилизации: емкости с твердыми кристаллами льда размещаются на поддоне лиофилайзера или вакуумном порте. В вакуумной среде пептидный продукт sublimeется, в конечном итоге давая твердый пептидный порошок.

Кристаллы пептидов готовы к лиофилизации в лиофилайзере.