Peptidrenskning

För att få peptide med specifika aminosyrföljder använder vi Fmoc-SPPS-metoden (solidfaspeptidsyntes).

Bakgrund:

Peptider är bioaktiva ämnen som är relaterade till olika cellfunktioner hos levande organismer. Deras molekylära struktur ligger mellan aminosyror och proteiner, bestående av flera aminosyror arrangerade i en specifik ordning och kopplade samman av peptidbindningar (—NH—CO—). Sammansättningar bildade av två aminosyromolekylers dehydrationskondensation kallas dipeptider, på liknande sätt finns det tripeptider, tetrapeptider, pentapeptider och så vidare, upp till nonapeptider. Sammansättningar som vanligtvis består av 10 till 100 aminosyromolekyler bildade genom dehydrationskondensation kallas polypeptider.

Peptidtjänster på beställning syftar till syntes av peptider baserat på kundkrav, såsom sekvens, renhet, molekylvikt och saltinnehåll, för att uppfylla specifika behov. Molekylvikten bekräftas genom masspektrometri för att säkerställa korrektheten av det råa MS, följt av renad med ett högpresterande vätskechromatografi-system, sedan koncentration och lyofilisering för att få fram det fina peptidpulver.

För att få peptider med specifika aminosyrföljderna använder vi Fmoc-SPPS-metoden (solidfas-peptidsyntes). Under solidfas-syntesen introduceras en grupp som kan reagera med karbalkylgrupper på den solidfasbärande för att reagera med det aminskyddade aminot, vilket fäster den första aminosyran till resinen. Reaktionen utförs sedan från C-änden till N-änden för att slutföra syntesen av målpeptidsekvensen.

Reningsmetoder:

Vår företag använder ett högeffektivt vätskechromatografi-system med en omvänd C18-preparativ kolumn för separering och renad, enligt följande steg:

Identifikation: Ta ett litet stickprov av den råa peptiden för masspektrometri för att bekräfta närvaron av målpeptiden (om ja, bekräfta dess halte tid i C18-kolumnen genom analytisk chromatografi; om nej, återsyntesier den råa peptiden).

Upplösning: Använd ultraljudsstöd för upplösning, vanligtvis väljer man 90% vatten + 10% acetonitril (metanol eller isopropanol). För svår upplösbarhet, lägg till lämplig mängd syrlig syra eller trifluoracetsyra för att hjälpa till med upplösningen om sekvensen har en högre proportion basiska aminosyror; lägg till lämplig mängd ammoniakvatten om sura aminosyror är dominerande. Använd DMSO (dimetyl sulfoxid) om hydrofoba aminosyror är dominerande.

Filtrering: Filtrera den upplösta råprodukten genom en 0.45 µm filtreringsmembran (för att skydda preparativa kolumnen) för senare användning.

Provsamling: Använd det högpresterande vätskeförberedningssystemet för att mata in vätskemönstret i förberedningskolonnen.

Elution: Basera på elutionsgradienten som fastställdes i steg 1) för att separera föroreningar från peptider med hjälp av polaritetsdifferenser hos peptider av varierande längd.

Fördelar med att använda ett högpresterande vätskekromatografi-system:

Högre upplösning än andra kromatografiska metoder; C18-förberedningskolonnen som används har hög kolonn-effektivitet, lång livslängd och god reproducerbarhet, vilket tillåter upprepade användningar; snabb hastighet och hög effektivitet, med varje prov som renas inom minuter eller tiotals minuter; bred tillämpning och mogen teknik för reversfased-kromatografi, vilket ger god selektivitet för olika typer av organiska sammansättningar.

Rå-peptidrening och lyofilisering:

Det råa peptidet separeras och renas med hjälp av ett högeffektivt vätskechromatografiskt förberedningssystem och analyseras på renhet med en högeffektiv vätskechromatograf (HPLC) för att få de kvalificerade vätskekomponenterna.

Rotationsavvätsningsystem: Den kvalificerade vätskekomponenten utsätts för vakuumuppvärmning för att ta bort lätt volatila organiska lösningsmedel, vilket slutligen resulterar i en lösning som innehåller målpeptidet, vilken sedan placeras i en fryser för att bildas till fasta iskristaller.

Kryoförvaringssystem: Behållare med fasta iskristaller placeras på trayen eller vakuumporten i kryoförvararen. I en vakuummiljö sublimeras peptidprodukten, vilket slutligen resulterar i fast peptidpulver.

Peptidkristallerna är redo att kryoförvaras i kryoförvararen.