Puripikasyon ng Peptide

Upang makakuha ng mga peptide na may tiyak na sekwenya ng amino asidong, ginagamit namin ang paraan ng Fmoc-SPPS (solid-phase peptide synthesis).

Mga background:

Ang mga peptido ay mga bioaktibong anyo na may kinalaman sa iba't ibang pangyayaring selular sa mga organismo. Ang kanilang molekular na estruktura ay nasa gitna ng amino asid at protina, binubuo ng maraming amino asid na pinag-iisda sa isang tiyak na pagkakasunod-sunod at nilalapat ng mga peptidong bond (—NH—CO—). Ang mga kompound na nabubuo sa pamamagitan ng dehidrasyon at kondensasyon ng dalawang amino asid molecule ay tinatawag na dipeptido, gayundin ang tripeptido, tetrapeptido, pentapeptido, atbp., hanggang sa nonapeptido. Ang mga kompound na karaniwang gawa sa 10 hanggang 100 amino asid molecule sa pamamagitan ng dehidrasyon at kondensasyon ay tinatawag na polipeptido.

Ang mga serbisyo ng paggawa ng peptide ay tumutukoy sa pagsasangguni ng mga peptide batay sa mga kinakailangan ng kliyente, tulad ng sekwenya, kalimutan, molekular na timbang, at halaga ng asin, upang tugunan ang mga tiyak na pangangailangan. Kinikumpirma ang molekular na timbang sa pamamagitan ng mas spektrometriya upang siguraduhin ang wastong pag-uulat ng kasarong MS, sunod ang pagpuri gamit ang sistemang high-performance liquid chromatography, pagkatapos ay pagsusumunod at lyophilization upang makakuha ng malinis na peptide poweder.

Upang makakuha ng mga peptide na may tiyak na sekwensya ng amino asid, ginagamit namin ang paraan ng Fmoc-SPPS (solid-phase peptide synthesis). Sa panahon ng solid-phase synthesis, ipinapasok ang isang grupo na maaaring magreaksiyon sa mga carboxylic groups sa solid-phase carrier upang magreaksiyon sa amino-protected amino, dumikit sa unang amino asid sa resin. Kumpletuhin ang reaksyon mula sa C-end patungo sa N-end upang matapos ang sintesis ng target peptide sequence.

Mga Paraan ng Pagpuri:

Gumagamit ang ating kompanya ng isang taas-na-paggawa na likido chromatography system na may baligtad na C18 preparatory column para sa paghiwa at pagsisilbi, sundin ang mga hakbang na ito:

Pagsasalita: Kumuha ng maliit na halaga ng kasukdulan ng peptide para sa mass spectrometry upang kumpirmahin ang presensya ng obhetsibong peptide (kung oo, kumpirmahin ang kanyang retention time sa C18 column sa pamamagitan ng analytical chromatography; kung hindi, muli mong isynthesize ang kasukdulan ng peptide).

Pagsisiyasat: Gamitin ang ultrasonic assistance para sa pagsisiyasat, tipikal na pinipili ang 90% tubig + 10% acetonitrile (methanol o isopropanol). Para sa mahirap mag-solve, idagdag angkop na acetic acid o trifluoroacetic acid upang tulungan ang pagsisiyasat kung may mas mataas na proporsyon ng basikong amino acids ang sequence; idagdag angkop na ammonia water kung dominante ang asidong amino acids. Gamitin ang DMSO (dimethyl sulfoxide) kung dominante ang hydrophobic amino acids.

Pagsala: I-filter ang nasisiyasat na kasukdulan ng produkto sa pamamagitan ng 0.45 µm filter membrane (upang iprotektahan ang preparatory column) para gamitin mamaya.

Pagloload ng Sample: Gumamit ng mataas-na-pagpoproseso na likido upang ipasok ang sample ng likido sa preparatory column.

Elusyon: Batay sa elusyon gradient na tinukoy sa hakbang 1), hiwalayin ang mga impurity mula sa mga peptide gamit ang mga pagkakaiba ng polaridad ng mga peptide na may iba't ibang haba.

Mga benepisyo ng paggamit ng mataas-na-pagpoproseso na kromatograpiya sa likido:

Mas mataas na resolusyon kaysa sa iba pang mga paraan ng kromatograpiya; ang ginagamit na C18 preparatory column ay may mataas na halaga ng halaga, mahabang buhay-buhay, at mabuting reproduktibidad, na nagpapahintulot sa muling paggamit; mabilis na bilis at mataas na efisiensiya, na bawat sample ay kinikilusan loob ng minuto o sampung minuto; malawak na aplikasyon at matatag na teknolohiya ng reverse-phase chromatography, na nagbibigay ng mabuting pagsasalungat para sa iba't ibang uri ng organikong kompound.

Pagkilusan at Paghiwa ng Mga Krudo na Peptide:

Ang kasuklob na peptido ay hihiwalay at ipinagpapuri gamit ang isang preparatoryong sistema ng high-performance liquid chromatography at ina-analyze para sa kalinisan gamit ang high-performance liquid chromatograph (HPLC) upang makuhang kwalipikadong likido.

Sistemang Rotary Evaporation: Ang kwalipikadong bahagi ng likido ay pinapaloob sa vacuum heating upang alisin ang madaling umuubos na organikong sulber, huling nakukuha ang solusyon na naglalaman ng obhektibong peptido, na pagkatapos ay iniiwan sa freezer upang mag-form ng maliging krystales.

Sistemang Freeze-Drying: Ang mga kotseng naglalaman ng maliging krystales ay iniiwan sa tray o vacuum port ng freeze-dryer. Sa isang kapaligiran ng vacuum, ang produkto ng peptido ay sublimated, humihigit sa huli na makakuha ng maliging babasahin ng peptido.

Ang mga krystal ng peptido ay handa para sa freeze-drying sa loob ng freeze-dryer.