Peptid Temizleme

Belirli amino asit dizileri olan peptidleri elde etmek için Fmoc-SPPS (katı fazlı peptid sentezi) yöntemini kullanırız.

arka plan:

Peptitler, biyolojik organizmlerde çeşitli hücresel fonksiyonlarla ilgili olan biyoaktif maddelerdir. Moleküler yapısı, amino asitler ve proteinler arasında yer alır ve belirli bir sırayla dizilmiş ve peptid bağları (—NH—CO—) ile bağlı birden fazla amino asitten oluşur. İki amino asit molekülünün dehidrasyon kondensasyonu sonucu oluşan bileşiklere dipeptitler denir, benzer şekilde tripeptitler, tetrapeptitler, pentapeptitler vb. vardır ve bu durum nonapeptitlere kadar devam eder. Dehidrasyon kondensasyonu yoluyla 10 ila 100 amino asit molekülünden oluşan bileşiklere polipeptitler denir.

Peptid özelleştirme hizmetleri, müşteri gereksinimlerine göre peptit sentezi yapmayı içerir. Bu gereksinimler sırasıyla dizilim, doğruluk, moleküler ağırlık ve tuz içeriği gibi unsurları içerebilir ki bu da belirli ihtiyaçları karşılamaktadır. Moleküler ağırlık, ilkel MS'nin (kütle spektrometrisi) doğruluğunu sağlamak için kütle spektrometrisi ile doğrulanır, ardından yüksek performanslı sıvı kromatografi sistemi kullanılarak temizleme yapılır, sonra konsantre edilir ve son olarak liofilizasyon uygulanarak pür peptit tozu elde edilir.

Belirli amino asit dizisine sahip peptitler elde etmek için Fmoc-SPPS (katı faz peptid sentezi) yöntemini kullanırız. Katı faz sentez sırasında, karboksilik gruplarıyla reaksiyon gösterebilen bir grup katı faz taşıyıcıya tanıtılarak amin korunan amin asitleriyle reaksiyona girmesine izin verilir ve ilk amino asit rezine bağlanır. Reaksiyon, hedef peptid dizisinin sentezi tamamlanana kadar C-ucundan N-ucuna doğru tamamlanır.

Temizleme Yöntemleri:

Şirketimiz, ayrıştırma ve temizleme için ters C18 hazırlık sütunu bulunan yüksek performanslı sıvı kromatografi sistemini şu adımları takip ederek kullanmaktadır:

Tanımlama: Hedef peptidin varlığını doğrulamak amacıyla brüt peptitten küçük bir miktar alarak kütle spektrometrisi yapın (eğer evet, hedef peptidin C18 sütundaki tutulum zamanını analitik kromatografi ile doğrulayın; eğer hayır, brüt peptidi yeniden sentezleyin).

Çözünüm: Çözünüm için ultrasonik destek kullanın, genellikle 90% su + 10% asetonitril (metanol veya izopropanol) karışımı tercih edilir. Daha zor çözünebilir durumlarda, dizide temel amino asitlerin oranı daha fazla ise uygun miktarda sirpit ya da trifluorsirpit ekleyerek çözünmeyi kolaylaştırın; asitli amino asitler baskın ise uygun miktarda amonya suyu ekleyin. Hidrofobik amino asitler baskın ise DMSO (dimetilsulkoksit) kullanabilirsiniz.

Filtreleme: Dissolve olan brüt ürünü (hazırlık sütununu korumak için) daha sonra kullanılacak şekilde 0.45 µm filtre membranı aracılığıyla filtreleyin.

Örnek Yükleme: Yüksek performanslı sıvı hazırlama sistemini, sıvı örneği hazırlama sütununa girmek için kullanın.

Elüsyon: Adım 1'de belirlenen elüsyon gradyeni temel alınarak, farklı boyutta olan peptidlerin kutupluluk farklarını kullanarak katı maddeleri peptitlerden ayırın.

Yüksek performanslı sıvı kromatografi sistemi kullanmanın avantajları:

Diğer kromatografi yöntemlerinden daha yüksek çözünürlük; kullanılan C18 hazırlama sütunu yüksek sütun verimliliği, uzun hizmet hayatı ve iyi tekrarlanabilirlik sağlar, bu da tekrarlı kullanımını mümkün kılar; hızlı hız ve yüksek verimlilik, her örnek birkaç dakika veya onlarca dakika içinde saf hale getirilir; ters faz kromatografisinin geniş uygulama alanı ve olgun teknolojisi, çeşitli türlerdeki organik bileşikler için iyi seçicilik sunar.

Kabas Peptid Temizleme ve Liofilizasyon:

Ham peptid, yüksek performanslı sıvı kromatografi hazırlık sistemi kullanılarak ayrılır ve temizlenir ve ardından yüksek performanslı sıvı kromatograf (HPLC) ile saflicki analiz edilir ki bu da nitelikli sıvı bileşenleri elde etmeye yarar.

Döner Evaporasyon Sistemi: Nitelikli sıvı bileşen, kolayca挥发edebilen organik çözücüleri kaldırmak için vakum ile ısıtılır ve nihayetinde hedef peptidi içeren bir çözüm elde edilir, ardından bu çözüm bir dondurucuda katı buz kristallerine dönüşür.

Dondurma Kurutma Sistemi: Katı buz kristallerini tutan kaplar, dondurma kurutucu tepsi veya vakum portuna yerleştirilir. Vakum ortamında, peptid ürünü sublime edilir ve sonunda katı peptit tozu elde edilir.

Peptit kristalleri, dondurma kurutucuda dondurma kurutmasına hazır hale gelir.