Очищення пептидів

Щоб отримати пептиди з специфічними послідовностями амінокислот, ми використовуємо метод Fmoc-SPPS (синтез пептидів у твердій фазі).

Приклад:

Пептиди — це біоактивні речовини, які пов'язані з різними клітинними функціями в біологічних організмах. Їх молекулярна структура знаходиться між амінокислотами та білками, складається з декількох амінокислот, упорядкованих в певній послідовності і зв'язаних пептидними зв'язками (—NH—CO—). Злічені композиції, що утворюються за допомогою десувативного конденсаційного процесу двох молекул амінокислот, називаються дипептидами, аналогічно існують трипептиди, тетрапептиди, пентапептиди тощо, до нонапептидів. Композиції, що зазвичай утворюються шляхом десувативного конденсаційного процесу від 10 до 100 молекул амінокислот, називаються поліпептидами.

Пептидні послуги на замовлення включають синтез пептидів згідно з вимогами клієнта, такими як послідовність, чистота, молекулярна маса та вміст солей, щоб задовольнити конкретні потреби. Молекулярна маса підтверджується мас-спектрометрією для забезпечення правильності початкової МС, після чого виконується очищення за допомогою системи високодослідного розшарування у рідині, концентрація та ліофілізація для отримання точного пептидного порошку.

Щоб отримати пептиди з певними амінокислотними послідовностями, ми використовуємо метод Fmoc-SPPS (синтез пептидів на твердій фазі). Під час синтезу на твердій фазі на твердому носії вводиться група, що може реагувати з карбоксил-групами, щоб вона реагувала з аміно-захищеним аміном, закріплюючи першу амінокислоту на резині. Реакція потім виконується від С-кінця до N-кінця для завершення синтезу цільової пептидної послідовності.

Методи очищення:

Наша компанія використовує систему високопродуктивної розчинної хроматографії з оберненою C18 підготовчою колонкою для розділення та очищення, дотримуючись наступних кроків:

ідентифікація: Візьміть невелику кількість сировинного пептиду для мас-спектрометрії, щоб підтвердити наявність цільового пептиду (якщо так, підтвердіть його час задержки у C18 колонці через аналітичну хроматографію; якщо ні, пересинтезуйте сировинний пептид).

Дисолюція: Використовуйте ультразвукову допомогу для дисолюції, зазвичай вибираючи 90% води + 10% ацетонітрілю (метанол або ізопропанол). Для складної дисолюції додайте відповідну кількість оцту або трифторацтової кислоти, щоб сприяти дисолюції, якщо послідовність має більшу частку основних амінокислот; додайте відповідну кількість аміаку, якщо переважають кислі амінокислоти. Використовуйте DMSO (діметилсулфоксид), якщо переважають гіdroфoбні амінокислоти.

Фільтрація: Профільтруйте розчинений сировинний продукт через фільтр-мембрани 0.45 µm (щоб захистити підготовчу колонку) для подальшого використання.

Завантаження вибірки: Використовуйте високопродуктивну рідинну приготувальну систему для введення рідинного зразка до приготувального стовпчика.

Елювання: На основі елювальних градієнтів, визначених у кроці 1), розділіть забруднення від пептидів за допомогою різниць у полярності пептидів різної довжини.

Переваги використання системи високопродуктивної рідинної хроматографії:

Вища розрізнювальна здатність, ніж у інших методів хроматографії; C18 приготувальний стовпчик, який використовується, має високу стовпчасту ефективність, довгий термін служби та хорошу воспроизводимість, що дозволяє його повторне використання; швидкість та висока ефективність, кожен зразок очищується протягом хвилин або десятків хвилин; широке застосування та досконалість технології обернено-фазової хроматографії, що забезпечує хорошу селективність для різноманітних органічних сполук.

Очищення неочищених пептидів та ліофілізація:

Сироватий пептид відокремлюється і очищується за допомогою системи приготування високодослідної розчинної хроматографії та аналізується на чистоту за допомогою високодослідної розчинної хроматографії (HPLC) для отримання якісних розчинних компонентів.

Ротаційна система еваляції: якісний розчинний компонент піддається вакуумному нагріванню для вилучення легковогарних органічних розчинників, остаточно отримуючи розчин, що містить цільовий пептид, після чого його поміщують у морозильну камеру для формування твердих кришталів льодя.

Система заморожено-сухого спекання: ємності з твердими кришталами льодя розміщуються на тележці або вакуумному порті заморожено-сухого спекача. У вакуумному середовищі продукт пептиду піддається сублімації, що в результаті дає твердий порошок пептида.

Кришталі пептида готові до заморожено-сухого спекання у заморожено-сухому спекачі.